USO DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TRPA1 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A INFECCIONES BACTERIANAS.

Uso de antagonistas del receptor TRPA1 para el tratamiento de enfermedades asociadas a infecciones bacterianas.

La presente invención se dirige al uso de un ligando antagonista del receptor TRPA1 para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianas.

USO DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TRPA1 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A INFECCIONES BACTERIANAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

ANTECEDENTES

Las infecciones bacterianas se acompañan de dolor somático o visceral que se atribuye a la sensibilización de los nociceptores como consecuencia de la activación de respuestas inflamatorias. La capacidad patógena de las bacterias gram negativas, generalmente se asocia con ciertos componentes de su membrana externa, en particular, el

lipopolisacárido (LPS) , también conocido como endotoxina (Raetz C. y Whitfield C., Annu. Rev. Biochem., 2002, 71, 635–700) . Cuando las bacterias son lisadas por las células del sistema inmunitario o por la acción de los antibióticos, el LPS se libera a nivel local y sistémico.

El LPS puede inducir varias reacciones potencialmente letales, incluyendo una fuerte estimulación de la respuesta inmune (Akira S. y Takeda K., Nat.Rev.Immunol., 2004, 4, 499-511; Poltorak A. y col., Science, 1998, 282, 2085-2088) , la constricción de las vías respiratorias (Michel O. y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1996, 154, 1641-1646) y una vasodilatación arterial que puede llevar a una severa caída en la presión arterial (Landr y D. W. y Oliver J. A., N.Engl.J.Med, 2001, 345, 588-595) . Además, el LPS

puede inducir síntomas de irritación y dolor que acompañan a muchas infecciones bacterianas tópicas y sistémicas. Cabe destacar que el dolor agudo y crónico es un síntoma muy frecuente en la meningitis, la pulpitis, el dolor de las heridas infectadas, cistitis bacteriana, la prostatitis crónica y el dolor abdominal crónico en el síndrome de intestino irritable post-infeccioso (Michel O. y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med.,

1996, 154, 1641-1646) .

Además, el LPS puede ser adquirido por la exposición al aire contaminado, polvo orgánico y el polvo en los hogares, lo que influye en la exacerbación de los síntomas del asma (Michel O. y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1996, 154, 1641-1646) . Incluso el humo de los cigarrillos contiene lipopolisacáridos, de los cuales aproximadamente el 5 1% persiste con capacidad bioactiva a la combustión, y se ha demostrado que fumar un paquete de cigarrillos diarios proporciona una dosis de LPS respirable que es comparable a los niveles de LPS que producen efectos adversos para la salud en trabajadores de la industria del algodón (Hasday y col., Chest, 1999, 115, 829-835) . La exposición al LPS provoca una respuesta inflamatoria acompañada de hipersensibilidad

de las vías respiratorias, por lo que el LPS del humo del cigarrillo podría contribuir a la etiología y/o exacerbación de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (Kharitonov y col., Contrib. Microbiol., 2007, 14, 83-100) . Además, podría contribuir a la patogénesis de la bronquitis crónica que se desarrolla en fumadores activos y pasivos (Hasday y col., Chest, 1999, 115, 829-835) .

Por otra parte, hay que señalar que los diferentes tipos de LPS y lípidos A son demasiado tóxicos para su uso como adyuvante en vacunas humanas y se han hecho numerosos intentos para detoxificar el LPS sin afectar a su capacidad inmunogénica. En este sentido, un derivado de LPS, MPL (lípido 3-O-descil-4’-monofosforilado) , modificado a partir del LPS de la pared celular de la bacteria gram negativa Salmonella minnesota, se usa como adyuvante en vacunas humanas comercializadas, debido a que presenta una menor capacidad proinflamatoria (Mata –Haro et al., Science, 2007, 15, 316, 1628-32) .

Las dianas principales del LPS son las células presentadoras de antígeno (APC) del sistema inmune donde se activa el receptor tipo Toll 4 (TLR4) . La activación del TLR4 25 supone la estimulación de una vía de señalización en APCs que es crítica para la liberación de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-alfa, IL-1, IL-6) . Estas citoquinas contribuyen a potenciar la respuesta inmune. Estudios recientes han documentado la expresión de TLR4 en neuronas (Wadachi y col., J. Dent. Res. 2006, 85, 49-53; Acosta y col., J. Neurosci. Res., 2008, 86, 1077-86) , pero hasta la fecha es una cuestión pendiente si el LPS puede provocar directamente la excitación de las fibras nerviosas aferentes, y en particular, de las neuronas nociceptoras.

Las neuronas nociceptoras reconocen estímulos mecánicos, térmicos y químicos que pueden resultar dañinos para el organismo. Por ello, los nociceptores son considerados como guardianes de la integridad tisular, y la nocicepción como un mecanismo de seguridad esencial para la vida. A nivel molecular, los nociceptores poseen en sus terminales un conjunto de receptores proteicos que reconocen y transducen los estímulos nocivos de tipo físico (mecánicos, osmóticos y térmico) y químicos.

Los canales TRP (Receptores de Potencial Transitorio) constituyen un familia de receptores nociceptores subdivididos en 8 subfamilias: TRPC, TRPM, TRPV, TRPA, TRPP, TRPML, TRPN y TRPY. Estos receptores juegan un papel fundamental en la 10 transducción de las distintas modalidades somatosensoriales en mamíferos, incluyendo la sensibilidad térmica, la recepción de feromonas, la regulación del tono vascular, la nocicepción y el dolor. Cada vez es más evidente que los canales TRP son muy importantes en la fisiología sensorial y que su alteración funcional, bien mediante mutaciones o por estímulos nocivos o factores pro-inflamatorios, conduce a estados patológicos en humanos.

En particular, el receptor TRPA1 es un canal iónico permeable de calcio no selectivo que regula el potencial de membrana modulando el flujo de cationes, no solo de calcio, sino también de otros iones como el sodio. Como otros miembros de la familia, los canales iónicos funcionales de TRPA1 se forman a través de la tetramerización de 4 20 subunidades, cada uno conteniendo seis dominios transmembrana, un ciclo de poro entre el dominio transmembrana 5 (S5) y 6 (S6) y N-y C-términos intracelulares. TRPA1 es expresado en neuronas sensoriales y co-localizado con marcadores de dolor tales como TRPV1, péptido relacionado con el gen cacitonina y receptor de bradiquinina (Corey D.P. y col, Nature 2004, 432, 723-730) En modelos de dolor, el 25 bloqueo de la expresión de TRPA1 a través de antisentidos de gen específico ha evitado e invertido la hiperalgesia inducida por inflamación y daño a nervios (Obata, K. y col., Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 2393-2401) . Además, el bloqueo de genes de TRPA1 altera la sensibilidad y evita la hipersensibilidad dolorosa evocada por bradiquinina (Kwan, K.Y. y col., Neuron 2006, 50, 277-289) . Colectivamente, estos datos sugieren que TRPA1 juega un papel importante en las funciones sensoriales y los estados de dolor.

Como un canal iónico de compuerta de ligando, TRPA1 puede ser activado a través de una variedad de estímulos, incluyendo el frío nocivo, cationes de calcio intracelular, sustancias endógenas (por ejemplo bradiquinina) , productos naturales pungentes (por ejemplo isotiocianato de arilo, o AITC) , irritantes ambientales (por ejemplo, acroleína) , 5 moléculas anfipáticas (por ejemplo, trinitrofenol y clorpromazina) y agentes farmacéuticos (por ejemplo, URB597) . La bradiquinina activa TRPA1 indirectamente a través de la via de fosfolipasa C después de la unión de ésta a sus receptores. El trinitrofenol y la clorpromazina abren el canal iónico TRPA1 induciendo una curvatura o crenación en la membrana de la bicapa lipídica (Xu, H. y col., Nat. Neurosci., 2006, 9,

628-635) . Más recientemente, se ha mostrado que los agonistas de TRPA1 pueden directamente interactuar con la proteína de canal. AITC y cinamaldehído modifican covalentemente varios residuos de cisteína y lisina localizados en el término N citoplásmico y activan dicho canal (Hinman, A. y col., Proceedings of the National Academy of Science USA, 2006, 103, 19564-19568) . Además, el catión calcio intracelular se une a los dominios del extremo EF de término N y media la abertura del canal (Zurborg, S: y col., Nature Neuroscience, 2007, 10, 277-279) .

Todos estos hallazgos han revelado papeles fisiológicos potenciales de TRPA1, y también indican que la compuerta del canal iónico TRPA1 puede involucrar diferentes mecanismos y determinantes moleculares. De esta manera, la modulación de TRPA1

puede tener muchas aplicaciones industriales y terapéuticas. En particular, diversos antagonistas de TRPA1 han sido descritos en el estado de la técnica como fármacos potencialmente adecuados... [Seguir leyendo]

1. Uso de un inhibidor de TRPA1 o de un inhibidor de una variante funcionalmente equivalente de dicha proteína, en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianas.

2. Uso según reivindicación 1, donde las infecciones bacterianas son causadas por bacterias gram negativas.

3. Uso según reivindicación 1 ó 2, donde las infecciones bacterianas son causadas por la bacteria Escherichia coli.

4. Uso según reivindicación 3, donde las infecciones bacterianas son causadas por los lipopolisacáridos procedentes de la membrana externa de la bacteria Escherichia coli.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las infecciones bacterianas se seleccionan entre infecciones del tracto urinario, infecciones del tracto respiratorio, infecciones del tejido dérmico, infecciones del plasma sanguíneo, infecciones estomacales e intestinales o infecciones del sistema nervioso central o periférico.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las enfermedades

o disfunciones producidas por infecciones bacterianas se seleccionan entre dolor agudo, dolor crónico, dolor abdominal, dolor nociceptivo, dolor inflamatorio e hipotensión asociada al shock séptico.

7. Uso según reivindicación 6, donde el dolor agudo y crónico es ocasionado por meningitis, pulpitis, dolor de heridas infectadas, cistitis bacteriana o prostatitis crónica.

8. Uso según reivindicación 6, donde el dolor abdominal es ocasionado por el síndrome de intestino irritable post-infeccioso.

9. Uso según reivindicación 1, donde las enfermedades o disfunciones producidas por la exposición a endotoxinas bacterianas se seleccionan entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y bronquitis crónica en fumadores activos y pasivos.

10. Uso según reivindicación 1, donde las enfermedades o disfunciones producidas por la exposición a endotoxinas bacterianas son enfermedades de tipo inflamatorio causadas por el uso de endotoxinas como adyuvantes en vacunas.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor de TRPA1 se selecciona del grupo que consiste en 2- (1, 3-dimetil-2, 6-dioxo-1, 2, 3, 6tetrahidro-7H-purin-7-il) -N- (4-isopropilfenil) acetamida (HC-030031) , oxima de 4 (4-clorofenil) -3-metil-3-buten-2-ona (AP18) , alcanfor, mentol, gadolinio, rojo de rutenio, gentamicina, amilorida y combinaciones de los mismos.

12. Uso según reivindicación 11, donde el inhibidor de TRPA1 es 2- (1, 3-dimetil-2, 6dioxo-1, 2, 3, 6-tetrahidro-7H-purin-7-il) -N- (4-isopropilfenil) acetamida (HC030031) .

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor de TRPA1 se administra en combinación con un agente terapéutico adecuado para el tratamiento de una enfermedad producida por una infección bacteriana o por exposición a endotoxinas bacterianas.

14. Uso según reivindicación 13, donde el agente terapéutico se selecciona entre un analgésico, un antibiótico, un antifúngico, un corticosteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroide, un fármaco que modifican la neovascularización, un antihistamínico, un neuropéptido, un neuromodulador y un bloqueante del canal de Na+.

15. Un inhibidor de TRPA1 o un inhibidor de una variante funcionalmente equivalente de TRPA1 para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o disfunciones producidas por infecciones bacterianas o por exposición a endotoxinas bacterianas.

Figura1

AB

LPS silvestre CA Caps

2, 0

2, 0

Fura ratio

Fura ratio

1, 5

1, 0

1, 5

1, 0

0, 5

0, 5

5 101520 Tiempo (min)

C D50

LPS Trpa1 KO CA Caps

Neuronas con respuesta (%)

2, 0

Fura ratio

1, 5

1, 0

0, 5

5 101520 0

Tiempo (min)

E

F

100 50 0

Frecuencia (impulsos / 5s)

Tiempo (min)

Figura 2

A 0, 9 B

MO 100 μM 100

Fura ratio

0, 6

0, 3

LPS 3 μg/ml

Fura ratio normalizado

60 40

0, 0 0

0 5 10 15 0, 1 1 10 100

Tiempo (min) LPS (μg/ml)

C 4 MO 20 μM

6

Corriente (nA)

I (nA)

3LPS 20 μg/ml

-100 -50

V (mV)

- 3-2

- 6 -4

02468 Tiempo (min)

D6 E

**

TRPA1-CHO

**

Corriente relativa @ -75 mV

Mock CHO 6

Corriente relativa

**

*

- mV +75 mV

Figura 3

AB

LPS 20 μg/ml

Control

2, 0

1, 5

1, 0

0, 5

0, 0 +175 mV

1 nA

- mV200 ms

-175 mV

-100 0 100 200 Voltaje (mV)

Figura 4

A BC

silvestre Trpa1 KO 1, 0

** 6 *

LPS

Cambio relativo de EIP

Cambio relativo de EEP

1, 5

Pausa respiratoria aumentada 15 10 5 0 0, 5

0, 0

60 120 180 240 300 Tiempo (min)

D60 E

60

Vasodilatacion (%)