Una levadura modificada que consume L-arabinosa.

Método para producir una cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae que utiliza L-arabinosa para la producción de etanol,

caracterizado porque una cepa de levadura se modifica mediante la introducción y expresión de un gen araA (L-arabinosa isomerasa), un gen araB (L- ribuloquinasa), y un gen araD (L-ribulosa-5-P 4-epimerasa), y que porta mutaciones adicionales en su genoma o sobreexpresa un gen TAL1 (transaldolasa), que le permite consumir L-arabinosa y producir etanol a partir de un medio que comprende L-arabinosa, mediante el que la cepa de levadura se modifica adicionalmente mediante la expresión de una forma mutante de la enzima L-ribuloquinasa de E. coli con una actividad reducida.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/SE2003/000749.

Solicitante: SCANDINAVIAN TECHNOLOGY GROUP AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: OLE RÖMERS VÄG 12 223 70 LUND SUECIA.

Inventor/es: BOLES, ECKHARD, BECKER, JESSICA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/18 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Levadura de panadería; Levadura de cerveza.
  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/52 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
  • C12N15/74 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.
  • C12P19/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Monosacáridos.
  • C12P7/06 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica.
  • C12R1/85 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Saccharomyces.

PDF original: ES-2256742_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Una levadura modificada que consume L-arabinosa.

Área técnica

La presente invención se refiere a una cepa de levadura modificada, preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae, que consume L-arabinosa a la vez que produce etanol, así como a un método para producir etanol.

Antecedentes de la invención

El etanol como combustible se considera como una alternativa adecuada a los combustibles fósiles y puede producirse a partir de biomasa de plantas, que es un recurso de bajo coste y renovable que está disponible en grandes cantidades. Por esta razón la biomasa de celulosa, que incluye restos agrícolas, desechos de papel, troceados de madera, etc., es una fuente de azúcares ideal que está disponible abundantemente para la fermentación a etanol. Por ejemplo, cuando la glucosa se produce a partir de cereales, se generan sub-productos que contienen hemi-celulosa que consisten principalmente en los azúcares pentosa arabinosa y xilosa (arabinoxilano). Éstos se utilizan actualmente como alimento de bajo coste para el ganado. Pero este recurso podría utilizarse de una manera más rentable si se integrara en el procesamiento del almidón existente que rinde etanol y derivados del almidón.

En el contexto de la conversión de azúcares de hemi-celulosa, es importante la fermentabilidad de la L-arabinosa. La aproximación se hace habitualmente teniendo en cuenta que los hidrolizados generados mediante pretratamiento con ácido diluído contienen sólo D-xilosa, debido a que éste es el azúcar de hemi-celulosa más abundante. Como consecuencia de esto, la mayoría de los estudios sobre la conversión de hidrolizados de hemi-celulosa se centran en la conversión de D-xilosa. Sin embargo, la hemi-celulosa al ser un heteropolisacárido contiene pentosanos y hexosanos. Aunque el xilano es el pentosano dominante y el glucomanano es el hexosano dominante, los niveles de arabinano son significativos en algunos materiales de biomasa. En particular, los niveles de arabinano son significativos en especies herbáceas en las que representa hasta el 10 a 20% de los carbohidratos no glucanos totales. Los biocatalizadores microbianos seleccionados para desarrollar o fermentar los hidrolizados obtenidos a partir de materiales con un contenido alto de arabinano deben tener, por lo tanto, la capacidad de fermentar L-arabinosa así como xilosa y preferiblemente también otros azúcares a etanol.

Muchos tipos de levaduras, especialmente Saccharomyces cerevisiae y las especies relacionadas, se han utilizado tradicionalmente para fermentar materias primas base basadas en glucosa a etanol mediante fermentación anaerobia debido a que son los microorganismos más seguros y eficaces para fermentar azúcares a etanol. Sin embargo, estas levaduras superiores que fermentan glucosa son incapaces de fermentar xilosa y L-arabinosa y también son incapaces de utilizar estos azúcares pentosa para crecer. Otras pocas especies de levaduras tales como Pichia stipitis y Candida shehatae pueden fermentar xilosa a etanol; sin embargo, no son tan eficaces como Saccharomyces en la fermentación de la glucosa y tienen una tolerancia para el etanol relativamente baja. Por lo tanto, no son adecuadas para la producción industrial a gran escala de etanol a partir de biomasa. Algunas levaduras pueden utilizar L-arabinosa para crecer pero ninguna levadura puede fermentarla a cantidades comerciales de etanol. Al contrario que las levaduras y los hongos, la mayoría de las bacterias, incluyendo E. coli y Bacillus subtilis, pueden utilizar L-arabinosa para el crecimiento aerobio y también son capaces de fermentarla a diferentes productos incluyendo etanol.

Sedlak y HO, Enzyme Microb. Technol. 28, (2001), pp. 16-24 describen una expresión del operón araBAD de E. coli, que codifica enzimas para metabolizar la L-arabinosa, en Saccharomyces cerevisiae. Gracias a esto, la cepa expresa araA, araB y araD, pero es incapaz de producir etanol.

Compendio de la invención

Ahora ha sido posible resolver este problema mediante la creación de una cepa nueva de la levadura Saccharomyces cerevisiae capaz de consumir L-arabinosa, y de producir etanol.

Descripción detallada de la presente invención

Sorprendentemente, se ha visto que es posible solucionar el problema de tener una levadura que consume L-arabinosa mediante la presente invención mediante la obtención de un método para producir una cepa de levadura que utiliza L-arabinosa para la producción de etanol, método que se caracteriza porque se modifica una cepa de levadura mediante la introducción y expresión del gen araA (L-arabinosa isomerasa) de B. subtilis, gen araB (L-ribuloquinasa) de E. coli y gen araD (L-ribulosa-5-P 4-epimerasa) de E. coli, y que posee mutaciones adicionales en su genoma o sobreexpresa el gen TAL1 (transaldolasa) de S. cerevisiae, lo que le permite consumir L-arabinosa y producir etanol.

La invención se describirá más en detalle en lo que sigue mediante referencia a varios experimentos descritos que explican la naturaleza de la invención.

La solicitud también abarca la cepa de Saccharomyces cerevisiae JBY25-4M (DSM 15560) y la cepa de Saccharomyces cerevisiae JBY24-3T (DSM 15559) que se depositaron en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen el 4 de abril, 2003 bajo la Convención de Budapest.

En primer lugar, los genes araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P 4-epimerasa) de E. coli se clonaron y sobreexpresaron detrás del fragmento del promotor fuerte HXT7 en vectores multicopia en cepas CEN.PK de S. cerevisiae. Mientras araA no produjo ninguna actividad L-arabinosa isomerasa en los transformantes de levadura, la sobreexpresión de araB produjo hasta 0,7 U/mg de proteína de actividad L-ribuloquinasa y araD produjo hasta 0,13 U/mg de proteína de actividad L-ribulosa-5-P 4-epimerasa. La transformación de CEN.PK2-1C con las tres construcciones juntas no permitió a los transformantes crecer en medio de L-arabinosa. Se ha visto que la galactosa permeasa de levaduras (Gal2) es capaz de transportar L-arabinosa [J. Bacteriol. 103, 671-678 (1970)]. La sobreexpresión simultánea de GAL2 detrás del promotor ADH1 junto a los genes bacterianos que metabolizan L-arabinosa tampoco permitió a los transformantes crecer en medio de L-arabinosa.

En segundo lugar, la clonación y sobreexpresión del gen araA de Bacillus subtilis detrás del fragmento de promotor fuerte HXT7 en vectores multicopia en la cepa CEN.PK2-1C de S. cerevisiae resultó en una proteína activa en levaduras, que produjo actividad L-arabinosa isomerasa en el orden de al menos algunas mU/mg de proteína. De manera similar, la sobreexpresión del gen araA de Mycobacterium smegmatis detrás del fragmento del promotor fuerte HXT7 en un vector multicopia en la cepa CEN.PK2-1C de S. cerevisiae produjo actividad L-arabinosa isomerasa.

Después, los transformantes que expresan el gen araA de B. subtilis junto a los genes araB y araD de E. coli así como el gen GAL2 de levadura se incubaron durante varias semanas en medios líquidos (sintético completo o sintético completo/0,1% extracto de levadura/0,2% peptona) siendo L-arabinosa la única fuente de carbono. Después de 4 a 5 días de incubación, los transformantes comenzaron a crecer lentamente en estos medios, al contrario que una cepa que contiene sólo cuatro vectores vacíos. Cuando las células alcanzaron una DO600 de 3 a 4, se inocularon en medio fresco a una DO600 de 0,3, y se crecieron adicionalmente. El crecimiento se hizo más rápido después de 10 días. Estas observaciones indican la aparición de mutaciones supresoras espontáneas que permiten a las células utilizar L-arabinosa más eficazmente. Si no, las células podrían adaptarse de alguna manera a la utilización de L-arabinosa.

Con el fin de distinguir entre mutaciones supresoras o un proceso de adaptación, los transformantes mutantes se crecieron en medio de glucosa y después se cambiaron de nuevo a medio de arabinosa. Empezaron a crecer en medio de arabinosa únicamente con una fase de latencia corta lo que indica que contienen mutaciones específicas que permiten a las células crecer en arabinosa. Las actividades de las tres enzimas heterólogas se determinaron en extractos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para producir una cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae que utiliza L-arabinosa para la producción de etanol, caracterizado porque una cepa de levadura se modifica mediante la introducción y expresión de un gen araA (L-arabinosa isomerasa), un gen araB (L-ribuloquinasa), y un gen araD (L-ribulosa-5-P 4-epimerasa), y que porta mutaciones adicionales en su genoma o sobreexpresa un gen TAL1 (transaldolasa), que le permite consumir L-arabinosa y producir etanol a partir de un medio que comprende L-arabinosa, mediante el que la cepa de levadura se modifica adicionalmente mediante la expresión de una forma mutante de la enzima L-ribuloquinasa de E. coli con una actividad reducida.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el gen araA es un gen araA de B. subtilis.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el gen araA es un gen araA de M. smegmatis.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el gen araB es un gen araB de E. coli.

5. Método según la reivindicación 1, en el que el gen araD es un gen araD de E. coli.

6. Método según la reivindicación 1, en el que el gen TAL1 es un gen TAL1 de S. cerevisiae.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la cepa de Saccharomyces cerevisiae es una cepa CEN.PK, preferiblemente CEN.PK2-1C.

8. Método según la reivindicación 1, en el que la cepa de Saccharomyces cerevisiae es una cepa de Saccharomyces cerevisiae W303.

9. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cepa de levadura se modifica adicionalmente mediante la sobreexpresión del gen GAL2 de levadura.

10. Método según la reivindicación 1, en el que el gen araB se sitúa detrás de un promotor débil.

11. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las modificaciones se realizan detrás del fragmento de promotor fuerte HXT7 en vectores multicopia en cepas CEN.PK de S. cerevisiae.

12. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las modificaciones se realizan detrás del fragmento de promotor fuerte HXT7 en vectores multicopia en cepas W303 de Saccharomyces cerevisiae.

13. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la cantidad de L-arabinosa en el medio de crecimiento es 2 a 200 g/L.

14. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cepa es la cepa JBY25-4M de Saccharomyces cerevisiae con el número de referencia DSM 15560.

15. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cepa es la cepa JBY24-3T de Saccharomyces cerevisiae con el número de referencia DSM 15559.

16. Método para producir etanol mediante levaduras fermentadoras, caracterizado porque una levadura modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 fermenta un medio de crecimiento que contiene L-arabinosa.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la cantidad de L-arabinosa en el medio de crecimiento es 2 a 200 g/L.


 

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