Tratamiento de imágenes por fluorescencia, programa de ordenador, producto de programa de ordenador y sistema de tratamiento de imágenes por fluorescencia.

Método de tratamiento de imágenes por fluorescencia que comprende:

a) iluminar una muestra (12) para excitar su fluorescencia y adquirir una imagen de la misma;

b) basándose en la información espacial y espectral de fluorescencia de la imagen de fluorescencia de lamuestra, segmentar la imagen en regiones de propiedades espectrales similares (b2);

c) para cada segmento de imagen, excitar la fluorescencia de la región de muestra correspondiente, y detectarla fluorescencia correspondiente (d2);

d) basándose en un modelado, determinar parámetros de fluorescencia esperados a partir de las señales defluorescencia detectadas para cada región;

e) explorar la muestra (12) y determinar parámetros de fluorescencia finales sobre la base de dichos parámetrosde fluorescencia esperados de la etapa d).

Tratamiento de imágenes por fluorescencia, programa de ordenador, producto de programa de ordenador y sistema de tratamiento de imágenes por fluorescencia.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general al tratamiento de imágenes por fluorescencia, y trata más particularmente sobre el tratamiento de imágenes de muestras biológicas por espectros o tiempos de vida de fluorescencia.

Antecedentes de la técnica El tratamiento de imágenes por fluorescencia es una potente técnica para el análisis de muestras biológicas. En el caso más sencillo, se usa un sistema de tratamiento de imágenes, tal como un microscopio de epifluorescencia equipado con una lámpara de excitación y un cubo de filtros, para iluminar la muestra con una longitud de onda mientras se forma su imagen con otra.

No obstante, se puede obtener considerablemente más información de la misma muestra si se utilizan las técnicas más avanzadas de Formación de Imágenes Hiperespectrales (HSI) o Formación de Imágenes por Tiempos de Vida de Fluorescencia (FLIM) . En una configuración HSI se adquiere el espectro completo de fluorescencia para cada punto del objeto. Es un método particularmente útil para discriminar claramente diferentes características estructurales dentro de una muestra cuando se utilizan múltiples colorantes fluorescentes cuyos espectros se solapan (T. Zimmermann, “Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95, 245-265 (2005) ) . En lugar de medir la intensidad (espectral) , el FLIM implica el establecimiento de correspondencias de los tiempos de decaimiento de fluorescencia (J.R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy (Kluwer Academics, 1999) ) , que pueden variar en función del entorno local de fluoróforos exógenos o endógenos. Un enfoque tan funcional del tratamiento de imágenes resulta muy adecuado para el estudio de procesos bioquímicos y biofísicos en tejidos y células, frecuentemente de una manera no destructiva (D.Elson, J.Requejo-Isidro, I.Munro et al. “Time domain fluorescence lifetime imaging applied to biological tissue” Photochem.Photobiol.Sci. 3, 795-801 (2004) ) .

El tratamiento de imágenes espectrales de campo amplio se lleva a cabo habitualmente usando un conjunto de filtros ópticos de emisión montados en un soporte de rueda de filtros o de cubo de filtros rotatorio. Este planteamiento es directo y relativamente económico, aunque habitualmente es bastante lento y engorroso debido a la conmutación mecánica de los filtros. De forma típica solamente se puede adquirir un número limitado de bandas espectrales, lo cual permite una separación solamente parcial de los espectros de fluorescencia solapados. Los sistemas HSI más versátiles utilizan dispositivos electro-ópticos tales como Filtros Sintonizables de Cristal Líquido (LCTF) , Filtros Dieléctricos Pasabanda Linealmente Variables (LVDF) o Filtros Sintonizables Acústico-Ópticos (AOTF) (M.Bouhifd, M.P.Whelan, M.Aprahamian, “Fluorescence imaging spectroscopy utilizing acouto-optic tuneable filter”, 5826A-23 (OptoIreland, 2005) ) . La solución de LCTF ofrece aproximadamente el 30% de la eficiencia de transmisión pasabanda, lo cual con frecuencia es inaceptable para aplicaciones con bajo nivel de luz. La resolución de los LVDF es aproximadamente 15 nm, su banda espectral cubre entre 400 y 700 nm, y su eficiencia de transmisión está en torno al 40%. Aunque estos parámetros son suficientemente buenos para el tratamiento estático de imágenes, el uso de un LCTF para HSI con el fin de estudiar el comportamiento dinámico en condiciones de bajo nivel de luz puede resultar problemático. El AOTF es un filtro óptico de ancho de banda variable, controlable de forma electrónica, que proporciona una versatilidad y un rendimiento significativos en comparación con otros filtros sintonizables. Soporta el acceso aleatorio a cualquier banda de transmisión o la sintonización espectral continua y, por lo tanto, resulta muy adecuado para el HSI cuando se combina con una cámara sensible. No obstante, todos estos sistemas de HSI de campo amplio basados en filtros sintonizables pueden padecer una calidad de imagen relativamente deficiente debido a la dispersión presente en la mayoría de muestras biológicas. Esto puede dar como resultado una reducción del contraste de la imagen y la pérdida de información cuantitativa, tal como la concentración de un fluoróforo.

Como alternativa, la reconstrucción de un mapa de fluorescencia realizando mediciones punto a punto ha demostrado entregar imágenes de calidad superior (B.W. Pogue, S.L. Gibbs, B. Chen, M. Savellano, “Fluorescence Imaging in Vivo: Raster Scanned Point Source Imaging Provides More accurate Quantification then Broad Beam Geometries” Technology in Cancer Research and Treatment 3, 15-21 (2004) ) , que revelan de forma más precisa la localización y concentración de marcadores fluorescentes. No obstante, debido a que este planteamiento requiere habitualmente una exploración de trama llevada a cabo por medio de sistemas electro-mecánicos complejos, el mismo resulta difícil y costoso de implementar.

En general, se puede realizar una aproximación al tratamiento de imágenes por tiempos de vida de fluorescencia en el dominio del tiempo de dos maneras, a saber, el tratamiento de imágenes por tiempos de vida de fluorescencia de campo amplio o la exploración de trama punto a punto. Los sistemas de tratamiento de imágenes de campo amplio (o haz ancho) utilizan una cámara con Intensificador Óptico Controlado por Compuerta (Gated and Optical

Intensified (GOI) ) en combinación con un láser pulsado de alta potencia. Típicamente, se irradia luz de excitación sobre el área a detectar y se captura la fluorescencia del área, toda de una vez, por medio de un sensor de matriz CCD para obtener así información de fluorescencia de una región bidimensional. Un sistema FLIM de este tipo es rápido (J.Requejo-Isidro, J.McGinty, I.Munro, D.S. Elson et al. “High-speed wide-field time-gated endoscopic fluorescence-lifetime imaging”, Optics Letters 29, 2249-2251 (2004) ) aunque demuestra una resolución temporal y espacial menor en comparación con mediciones de exploración. El coste elevado y la falta de portabilidad son también problemas que han limitado su aceptación. Por otro lado, la revelación exitosa del FLIM basado en GOI que usa diodos láser de picosegundos ha sido de cierta ayuda (D.S.Elson et al., “Fluorescence lifetime system for microscopy and multiwell plate imaging with blue picosecond diode laser”, Optics Letter 12, 1409-1411 (2002) ) .

Todavía con respecto al tratamiento de imágenes de campo amplio, puesto que la información de fluorescencia del área tomada de la imagen se detecta como un todo al mismo tiempo, pueden aparecer problemas de imágenes borrosas debido a la dispersión de la luz. De hecho, puesto que el área de captación de la imagen se ilumina como un todo por medio de una fuente de luz, la detección y separación de la fluorescencia débil resulta difícil cuando hay múltiples puntos de fluorescencia en torno al punto débil, ya que la luz de fluorescencia se dispersa por todo el área vecina, lo cual hace que aumente al ruido de fondo y que se solape la fluorescencia a medir. Para evitar estos problemas, se han desarrollado dispositivos generadores de patrones de luz de excitación que permiten irradiar diferentes intensidades y ubicaciones sobre una muestra de forma secuencial con una frecuencia de cuadro relativamente alta. Por ejemplo, en el documento US 2006/0226375 se describe un aparato de detección de fluorescencia que usa un dispositivo generador de patrones de luz de excitación de este tipo, basado en un dispositivo digital de microespejos (DMD) o un dispositivo de cristal líquido de tipo reflectante.

El segundo planteamiento (del tipo exploración) para el FLIM en el dominio del tiempo saca provecho del método de Espectroscopia de Fotones Individuales con Correlación en el Tiempo (TCSPS) combinado con la exploración punto a punto (Y.Zhang, S.A.Soper, L.R. Middendorf, J.A. Wurn, R.Erdmann, M.Wahl, “Simple Near-Infrared Time-Correlated Single Photon Counting Instrument with a Pulsed Diode Laser and Avalanche Photodiode for Time-Resolved Measurements in Scanning Applications”, Applied Spectroscopy 53, 497-504 (1999) ) o el barrido confocal de láser (M.Kress, T.Meier, R.Steiner, F.Dolp, R.Erdmann, U.Ortmann, A.Rück, “Time-resolved microspectrofluorometr y and fluorescence lifetime imaging of photosensitizers using picosecond pulsed diode lasers in laser scanning microscopes”, Journal of Biomedical Optics 8, 26-32 (2003) ) . Típicamente, un haz de luz puntual correspondiente a la luz de excitación... [Seguir leyendo]

1. Método de tratamiento de imágenes por fluorescencia que comprende:

a) iluminar una muestra (12) para excitar su fluorescencia y adquirir una imagen de la misma;

b) basándose en la información espacial y espectral de fluorescencia de la imagen de fluorescencia de la muestra, segmentar la imagen en regiones de propiedades espectrales similares (b2) ;

c) para cada segmento de imagen, excitar la fluorescencia de la región de muestra correspondiente, y detectar la fluorescencia correspondiente (d2) ;

d) basándose en un modelado, determinar parámetros de fluorescencia esperados a partir de las señales de fluorescencia detectadas para cada región;

e) explorar la muestra (12) y determinar parámetros de fluorescencia finales sobre la base de dichos parámetros de fluorescencia esperados de la etapa d) .

2. Método según la reivindicación 1, en el que dichos parámetros de fluorescencia finales se determinan por medio de un algoritmo o algoritmos de ajuste que usan los parámetros de fluorescencia esperados como parámetros iniciales.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa e) implica la exploración, preferentemente exploración de trama (f1) , de la muestra completa (12) usando un haz de luz de excitación, puntual, y la detección de la fluorescencia emitida por medio de un fotodetector (20) dedicado a la detección de tiempos de vida de fluorescencia

o espectros de fluorescencia.

4. Método según la reivindicación 1, 2 o 3, en el que dicha etapa de exploración e) implica la detección de información espectral y/o de intensidad y/o información temporal de fluorescencia y/o información de polarización de fluorescencia para cada punto explorado.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos parámetros de fluorescencia esperados, respectivamente parámetros de fluorescencia finales, comprenden por lo menos un parámetro de tiempo de vida o de espectro de fluorescencia.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa c) implica la iluminación de cada región por medio de un dispositivo generador de patrones de luz de excitación (16) y la detección de la fluorescencia emitida por medio de un fotodetector (20) que genera dichas señales de fluorescencia.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una etapa de calibración preliminar, en el que se establece una correlación espacial entre el área que es iluminada por el dispositivo generador de patrones de luz de excitación (16) y la imagen detectada correspondiente.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de segmentación b) se basa adicionalmente en intensidades detectadas.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la etapa e) , dichos parámetros de fluorescencia finales se determinan mediante modelado a partir de los datos de fluorescencia explorados y usando dichos parámetros de fluorescencia esperados como información a priori para dicho modelado.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la etapa adicional f) de construir una imagen de tiempo de vida de fluorescencia o espectro de fluorescencia que proporciona un mapa de los parámetros de fluorescencia finales para la muestra analizada (12) .

11. Método de tratamiento de imágenes por fluorescencia, que comprende:

a) iluminar una muestra (12) para excitar su fluorescencia y adquirir una imagen de la misma;

b) basándose en información espacial y espectral de fluorescencia de la imagen de fluorescencia de la muestra, segmentar la imagen en regiones de propiedades espectrales similares;

c) para cada segmento de imagen, excitar la fluorescencia de la región de muestra correspondiente, y detectar la fluorescencia correspondiente;

d) basándose en un modelado, determinar parámetros de fluorescencia a partir de las señales de fluorescencia detectadas para cada región;

e) construir imágenes por tiempos de vida de fluorescencia o espectros de fluorescencia que proporcionan un mapa de los parámetros de fluorescencia correspondientes a dichos parámetros de fluorescencia de la etapa d) .

12. Programa de ordenador que comprende unos medios de código de programa de ordenador adaptados para llevar a cabo el método que tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores cuando dicho programa se ejecuta en un ordenador.

13. Producto de programa de ordenador que comprende unos medios de código de programa almacenados en un soporte legible por ordenador para llevar a cabo el método tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 cuando dicho producto de programa se ejecuta en un ordenador.

14. Sistema de tratamiento de imágenes por fluorescencia (10) , para analizar una muestra (12) , y dispuesto para 15 llevar a cabo el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende:

• una fuente de luz de excitación (14) ;

• un dispositivo generador de patrones de luz de excitación (16) iluminado por dicha fuente de luz de excitación 20 (14) y con capacidad de producir patrones de luz sobre una muestra (12) a analizar;

• un dispositivo de tratamiento de imágenes (18) que produce imágenes de fluorescencia de campo completo con información espectral;

• un fotodetector (20) para detectar fluorescencia emitida por un punto o región excitado sobre la muestra (12) ;

• unos medios de control programables (22) para controlar dicho dispositivo generador de patrones de luz de excitación (16) y adquirir datos experimentales a partir de dicho dispositivo de tratamiento de imágenes (10) y dicho fotodetector (20) .