Un método para protección de una planta transplastómica que comprende los pasos de:

a) Introducir el un plasto de una célula vegetal un vector de transformación de plastos que comprende dos constructos marcadores seleccionables distintos, en donde el primer constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un primer marcador seleccionable que confiere resistencia a un compuesto selectivo no letal, y el segundo constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un segundo marcador seleccionable que confiere tolerancia a un compuesto letal,

en donde el primer constructo marcador seleccionable está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y el segundo constructo marcador seleccionable está flanqueado por secuencias de ácido nucleico que son homólogas a secuencias de ácido nucleico diana de plastos no esenciales;

b) poner la célula vegetal en un primer medio de cultivo que comprende un compuesto no letal para el plasto al cual confiere resistencia el primer marcador seleccionable, durante 1) un periodo de aproximadamente 2 semanas o 2) hasta que aparecen brotes en un callo formado a partir de la célula vegetal; y

c) poner la célula vegetal en un segundo medio de cultivo que comprende un compuesto letal para el plasto al cual confiere resistencia el segundo marcador seleccionable durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la célula vegetal sea homoplásmica para el marcador letal; y

d) obtener una planta transplastómica que comprende únicamente el segundo marcador, letal.

Transformación de plastos Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la transformación de plastos. La invención proporciona vectores y métodos de transformación para obtener plantas o algas transplastómicas que tienen un plasto transformado que comprenden los pasos de introducción en los plastos de una molécula o vector de ácido nucleico recombinante, y dos fases de selección, utilizando la primera fase de selección un compuesto no letal y utilizando una segunda fase de selección un compuesto letal. Como alternativa, el método de selección dual se conduce simultáneamente, utilizando una concentración menor del compuesto letal.

Antecedentes de la invención La mejora de variedades de plantas por transformación ha adquirido una importancia creciente para la reproducción moderna de las plantas. Diversas tecnologías de transferencia de genes permiten la incorporación de moléculas de DNA extraño en los genomas de las plantas. La expresión de genes codificados por tales moléculas de DNA extraño (transgenes, genes de interés) puede conferir en potencia nuevas características beneficiosas a la planta como, por ejemplo, calidad o rendimiento mejorados de la cosecha. La expresión de transgenes puede permitir también el uso de las plantas como factorías bioorgánicas.

La mayoría de los sistemas de transferencia de genes, tales como la transformación mediada por Agrobacterium o el bombardeo con partículas recubiertas de DNA, integran de manera estable genes heterólogos en el genoma nuclear de la planta por medio de recombinación no homóloga. La ingeniería de las plantas utilizando estos métodos presenta varios inconvenientes. Estos métodos producen una población de transformantes que varía en el número de copias de su transgén y cuya expresión es a menudo impredecible debido a variaciones de efecto de posición o posible silenciación de genes. La mayoría de las plantas transgénicas producidas por estos métodos contienen en su genoma nuclear secuencias de vectores no deseadas asociadas con el gen de interés. Adicionalmente, la amenaza de contaminación del transgén de plantas salvajes afines por la planta genéticamente modificada es un problema ambiental importante. El riesgo de escape de transgenes de cosechas alteradas genéticamente a sus afines salvajes se origina predominantemente por diseminación del polen.

La transformación de genes de plastos es una alternativa importante para la expresión de genes heterólogos en plantas (revisado por Bogorad, Trends Biotechnol, 18: 257-263, 2000 y Bock, J. Mol. Biol. 312: 425-438, 2001) . Aunque los genomas de los plastos son de tamaño relativamente pequeño, 120 a 160 kb, los mismos pueden acomodar fácilmente varias kilobases de DNA extraño en su interior. La inserción de DNA extraño en el genoma del plasto ocurre principalmente por recombinación homóloga, y un transgén puede dirigirse de modo orientado a un locus particular utilizando regiones flanqueantes homólogas adecuadas. Una de las ventajas principales de la transformación de plastos es que es posible obtener una expresión muy alta del transgén. El genoma del plasto (plastoma) es altamente poliploide, por lo que el transgén se expresa a partir de copias múltiples del gen en el plasto. La poliploidía del genoma de los plastos es tal que una célula de hoja madura puede contener más de 10.000 copias del plastoma. Como factor que contribuye también al alto nivel de la expresión del transgén en los plastos se encuentra la ausencia de los efectos de posición y silenciación de genes. Otra ventaja importante es que los plastos de la mayoría de las plantas de cosecha se heredan sólo por vía materna y por consiguiente, el riesgo ecológico de escape de transgenes de plastos por cruzamiento exogámico mediado por el polen se minimiza.

Las técnicas básicas de suministro de DNA para transformación de plastos son la vía de bombardeo con partículas de las hojas o la incorporación de DNA mediada por polietilenglicol en protoplastos. La transformación de plastos por biolística se realizó inicialmente en el alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., Science 240: 1534-1537, 1988) y este método, utilizando selección para loci con acción cis de resistencia a los anti-bióticos (resistencia a espectinomicina/estreptomicina) o complementación de fenotipos mutantes no-fotosintéticos, se extendió a Nicotiana tabacum (Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530, 1990) , Arabidopsis (Sikdar et al., Plant Cell Reports 18:20-24, 1991) , Brassica napus (WO 00/39313) , patata (Sidorov et al., The Plant Journal 19 (2) :209-216, 1999) , petunia (WO 00/28014) , tomate (Ruf et al., Nature Biotechnology 19: 870-875, 2001) , colza de semilla oleaginosa (Hou et al., Transgenic Res. 12: 111-114, 2003) y Lesquerella fendleri (Skarjinskaia et al., Transgenic Res. 12: 115-122, 2003) . La transformación en plastos de protoplastos de tabaco y del musgo Physcomitrella patens se ha conseguido utilizando incorporación de DNA mediada por polietilenglicol (PEG) (O'Neill et al., Plant J.

3: 729-738, 1993; Koop et al., Planta 199: 193-201, 1996) . Más recientemente, la micro-inyección de DNA directamente en plastos de células marginales mesófilas de plantas intactas de tabaco dio como resultado una expresión transitoria (Knoblauch et al., Nature Biotechnology 17: 906-909, 1999) pero no se ha informado hasta ahora de transformantes estables utilizando esta técnica. Se ha publicado también la transformación estable de cloroplastos por biolística para la Euglenofita Eugena gracilis (Doetsch et al., Curr. Genet. 39: 49-60, 2001) y el alga roja unicelular Porphyridium sp (Lapidot et al., Plant Physiol. 129: 7-12, 2002) , el marcador dominante seleccionable utilizado para la última consiste en una forma mutante del gen codificante de acetohidroxiacido-sintasa que confiere tolerancia al herbicida sulfometurón-metilo. Como se ha mencionado anteriormente, la transformación de cloroplastos consiste en la integración de un DNA extraño en una posición precisa en el genoma del plasto por recombinación homóloga. Los vectores de transformación de plastos están constituidos por DNA del plasto clonado, homólogo a la región diana, que flanquea un gen marcador seleccionable que está enlazado a su vez a un gen o varios genes de interés. Después de la transformación, el o los transgenes y el marcador seleccionable se insertan juntos como un bloque de secuencia heteróloga en el locus diana del genoma del plasto por recombinación homóloga entre los vectores secuencia del plasto y el locus diana. Para obtener plantas homoplásmicas transformadas de manera estable, es decir plantas que tengan el DNA extraño insertado en cada copia del plastoma de la célula de la planta, se requieren varias tandas de subcultivo en medios selectivos. Este proceso facilita la segregación de plastos transplastómicos y no transformados y da como resultado la selección de células homoplásmicas con uno o más genes de interés y el marcador seleccionable integrado de manera estable en el plastoma, dado que estos genes están enlazados unos a otros.

La mayoría de las transformaciones estables de plastos demostradas hasta la fecha se han basado en selección utilizando el gen aadA de resistencia a antibióticos (como se ha indicado arriba en las referencias anteriores) o NPTII (Carrer et al., Mol Gen Genet 241: 49-56, 1993) , para obtener plantas homoplásmicas. La eficiencia de transformación de la transformación de plastos podría aumentarse sustancialmente por el empleo de un gen aadA quimérico, que confiere resistencia contra Espectinomicina y Estreptomicina (Svab y Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 913-917) . Estos marcadores seleccionables confieren un fenotipo de selección específico, la pigmentación verde (US 5.451.513) , que permite distinguir visualmente las células transplastómicas pigmentadas en verde de las células que tienen plastos de tipo salvaje que no se pigmentan en las condiciones seleccionadas.

La mayoría de los métodos de transformación de plastos están basados en el uso de un marcador seleccionable que confiere una selección no letal. Estos marcadores seleccionables confieren también un fenotipo de selección específico, la pigmentación verde (Patente U.S. No. 5.451.513) que permite distinguir visualmente las células transplastómicas pigmentadas en verde de las células que tienen plastos de tipo salvaje que no se pigmentan en las condiciones seleccionadas. Por ejemplo, plantas transformadas con el gen bacteriano aadA que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina crecen normalmente en presencia de uno cualquiera de estos antibióticos,... [Seguir leyendo]

1. Un método para protección de una planta transplastómica que comprende los pasos de:

a) Introducir el un plasto de una célula vegetal un vector de transformación de plastos que comprende dos constructos marcadores seleccionables distintos, en donde el primer constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un primer marcador seleccionable que confiere resistencia a un compuesto selectivo no letal, y el segundo constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un segundo marcador seleccionable que confiere tolerancia a un compuesto letal, en donde el primer constructo marcador seleccionable está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y el segundo constructo marcador seleccionable está flanqueado por secuencias de ácido nucleico que son homólogas a secuencias de ácido nucleico diana de plastos no esenciales;

b) poner la célula vegetal en un primer medio de cultivo que comprende un compuesto no letal para el plasto al cual confiere resistencia el primer marcador seleccionable, durante 1) un periodo de aproximadamente 2 semanas o 2) hasta que aparecen brotes en un callo formado a partir de la célula vegetal; y c) poner la célula vegetal en un segundo medio de cultivo que comprende un compuesto letal para el plasto al cual confiere resistencia el segundo marcador seleccionable durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la célula vegetal sea homoplásmica para el marcador letal; y d) obtener una planta transplastómica que comprende únicamente el segundo marcador, letal.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el vector de transformación de plastos comprende adicionalmente uno o más constructos de productos génicos de interés expresables en plastos adyacentes al marcador letal.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el marcador letal y el constructo génico o constructos génicos están organizados como un gen policistrónico semejante a un operón.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el marcador no letal es un gen de resistencia a antibióticos.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el gen de resistencia a antibióticos es aadA y el compuesto selectivo no letal es espectinomicina o estreptomicina.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el marcador letal es un gen de tolerancia a los herbicidas.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el gen de tolerancia a los herbicidas es una forma mutada de una protoporfirinógeno-oxidasa y el compuesto selectivo letal es butafenacil o Fórmula XVII.

8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho vector de transformación de plastos comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 19.

9. Un vector de transformación de plastos que comprende un marcador no letal que está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y un marcador letal flanqueado por secuencias que son homólogas a secuencias de DNA de plastos no esenciales.

10. El vector de transformación de plastos de la reivindicación 9, que comprende SEQ ID NO: 1 cuando el marcador no letal está presente en la cadena principal del vector.

11. Un vector de transformación de plastos que comprende un marcador no letal que está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y un marcador letal adyacente a uno o más constructos de productos génicos de interés expresables en plastos flanqueados por secuencias que son homólogas a secuencias de DNA de plastos no esenciales, en donde el marcador letal y el constructo génico o constructos génicos tienen promotores diferentes funcionales en plastos y se expresan independientemente, o en donde el marcador letal y el constructo génico o constructos génicos están organizados como un gen policistrónico semejante a un operón.

12. El vector de transformación de plastos de la reivindicación 11, que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:

19.

Figura 1

7, 6 Kpb

Figura 2 Figura 3 Figura 4

Figura 5

Inserción de PPO

Inserción del vector A

Inserción del vector B

Inserción del vector A Inserción del vector B Inserción de PPO

Tipo salvaje Figura 6

Locus del plasto direccionado

Plásmido pNY2C

Población mixta Entrecruzamiento doble 1 y 3

Entrecruzamiento doble 1 y 2

Entrecruzamiento doble 2 y 3

Homoplásmico para PPO y tipo salvaje ycf2

Selección con espectinomicina Selección con butafenacil Figura 7

10011 pb

rDNA 16S