Transferencia de energía fluorescente mediante hibridacion competitiva.

Un método de seguimiento de la amplificación de ácidos nucleicos que comprende lo siguiente:

llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos sobre un polinucleótido diana utilizando cualquier método, dondedicha amplificación se lleva utilizando

una primera sonda oligonucleotídica, y

una segunda sonda oligonucleotídica con una molécula desactivadora capaz de desactivar la fluorescencia del fluoróforo

mencionado,

en el que el fluoróforo y el desactivador están unidos a sus sondas respectivas en unas posiciones que resultan en ladesactivación de la fluorescencia del fluoróforo mediante la molécula desactivadora cuando las dos sondas estánhibridadas entre sí,

en el que la segunda sonda de oligonucleótido que es complementaria a la primera sonda de oligonucleótido, es almenos dos pares de bases más corta que la primera sonda de oligonucleótido, y en el que las sondas se seleccionande forma que la Tm del complejo de la sonda de oligonucleótido es entre 5 y 10ºC superior a la temperatura de hibridación de la reacción de amplificación monitorizada, y

en el que la primera sonda de oligonucleótido se une preferentemente al ácido nucleico diana sobre la segunda sondade oligonucleótido con el efecto que la fluorescencia del fluoróforo es superior cuando la primera sonda de oligonucleótidohibrida con el ácido nucleico diana que cuando hibrida con la segunda sonda de oligonucleótido, y

monitorizar la fluorescencia del fluoróforo, la generación de fluorescencia que corresponde a la presencia de ácidosnucleicos diana;

en el que el método de amplificación es la PCR.

Transferencia de energía fluorescente mediante hibridación competitiva Alcance de la invención Esta invención está relacionada con sondas complementarias de longitud desigual que tienen un fluoróforo en una sonda y un desactivador de fluorescencia en la otra. El fluoróforo y el desactivador se encuentran yuxtapuestos de tal forma que la proximidad del desactivador al fluoróforo desactiva la fluorescencia del fluoróforo. Estas sondas son útiles en la detección de nucleótidos con complementariedad de secuencia. Las capacidades de detección residen en la hibridación competitiva resultante de la utilización de sondas de longitud desigual y la consiguiente disminución de la desactivación producida por esta hibridación competitiva.

Área de la Invención Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos se han unido al conjunto de técnicas mediante las que se pueden aumentar cantidades muy pequeñas de nucleótidos hasta alcanzar una concentración que permita su detección por algún método. Hay diversas técnicas de amplificación que ya están disponibles. La técnica más extendida es la de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, como se la denomina comúnmente en la actualidad. Mientras las técnicas de amplificación aumentan el número de secuencias nucleotídicas diana disponibles para su detección, recuperación o uso, es necesario encontrar un método sensible para detectar el producto de amplificación. Además, las tecnologías de amplificación tienen la ventaja de disponer de un seguimiento en tiempo real del proceso de amplificación lo cual permite detectar series de amplificación no reactivas o ineficiencias del proceso. La cuantificación de la carga oligonucleotídica también se puede realizar mediante el seguimiento en tiempo real si éste puede llevarse a cabo sin interferir con la reacción de amplificación.

El procedimiento de esta invención se basa en la transferencia de energía fluorescente entre una sonda marcada con un fluoróforo y una sonda marcada con desactivador con complementariedad de secuencia entre ellas. Las sondas utilizadas son de longitud desigual favoreciendo así la hibridación de una sonda con la secuencia del ácido nucleico diana frente a la hibridación con su sonda complementaria. En ausencia de ácidos nucleicos con secuencias complementarias o idénticas a las secuencias de la sonda (secuencia diana) , las dos sondas hibridarían entre sí. Cuando las dos sondas están hibridadas entre sí la proximidad del desactivador respecto al fluoróforo provoca la desactivación de la fluorescencia del fluoróforo. En presencia de ácido nucleico con secuencias complementarias o idénticas a la secuencia de la sonda, algunas de las sondas marcadas con fluoróforo hibridarán con el ácido nucleico de secuencia complementaria, serán separadas del desactivador y producirán una fluorescencia aumentada (activada) . Esta diferencia de fluorescencia se puede utilizar para la detección específica de la presencia de ácidos nucleicos con las secuencias diana.

La patente US 5.565.322 está relacionada con sistemas de transferencia de energía basados en moléculas de ácidos nucleicos y en particular el ensamblaje de estructuras protónicas. Es una característica esencial de este documento que se utilice un oligonucleótido que comprende al menos dos cromóforos donadores en una distancia de transferencia donador-donador y un cromóforo aceptor que puede estar presente en la misma cadena, o alternativamente en un oligonucleótido separado. Además, este documento, muestra la utilización de una sonda desactivadora que desactiva la señal del cromóforo aceptor en ausencia de la diana. Este documento, no obstante, no tiene éxito en la descripción de (i) un método para monitorizar la amplificación de ácidos nucleicos y (ii) un grupo de sondas que consiste en un fluoróforo y una sonda-desactivadora que son complementarios entre ellos pero tienen una longitud diferente y forman un complejo que posee una temperatura de fusión seleccionada de forma que el complejo no se disocia durante la fase de hibridación del cebador en una reacción de PCR.

Este documento, WO 97/29210, describe un método para detectar un ácido nucleico diana durante una reacción de PCR mediante la utilización de dos sondas. La primera sonda posee un 5'-fluoróforo y la segunda sonda posee un 3'desactivador que es complementario a la primera sonda. De acuerdo con este documento, ambas sondas difieren en su longitud de forma que su temperatura de fusión difiere en al menos 10ºC y la Tm de la primera sonda es igual o superior que la de los cebadores de PCR, mientras que la Tm de la segunda sonda es inferior que la temperatura en la que tiene lugar la ciclación térmica de la PCR (es decir, por debajo de la Tm de los cebadores de la PCR) . Esto posee el efecto que durante toda la reacción de PCR ambas sondas no están hibridadas entre ellas resultando en una fuerte fluorescencia de fondo que solamente puede desactivarse mediante el enfriamiento de la reacción de PCR por debajo de la Tm de la segunda sonda (es decir, parando de forma efectiva la ciclación térmica) . Así, este documento, no permite debido al diseño de sus sondas monitorizar a tiempo real la reacción de amplificación.

La PE 0745690 describe sondas de hibridación unimoleculares y bimoleculares que comprenden una secuencia complementaria a la diana, una pareja de afinidad y una pareja de marcajes. Este documento, no logra describir dobletes de sondas que asemejen aquellas de las reivindicaciones anexadas, es decir, son complementarias entre ellas pero difieren en longitud por lo que la sonda más larga se une preferentemente a la diana por encima de la otra cadena de la sonda y posee una Tm que es superior que la temperatura de hibridación de la reacción de amplificación para poder permitir una detección de diana a tiempo real durante una reacción de amplificación que está en marcha, dejando tan solo un método para monitorizar amplificación de ácidos nucleicos utilizando un doblete de sondas.

Ambas WO 96/34983 y US 5.538.848 están relacionadas con los métodos y reactivos que permiten la combinación de la amplificación y la detección (mediante la hibridación de una sonda) . No obstante, ambas describen solamente sondas de cadena sencilla en las que el desactivador y el fluoróforo están acoplados a extremos opuestos de la misma sonda. Por lo tanto, estos documentos, no logran describir un doblete de sondas como el que se reivindica en las reivindicaciones anexadas.

Mötisson et al. (1989) , está relacionada con la detección de ácidos nucleicos mediante la utilización de sondas de DNA que contienen marcajes sensibles a la hibridación. Este documento describe un doblete de sondas, en el que una cadena posee un 5'-fluoróforo y la otra cadena posee un 3'-desactivador de dicho fluoróforo. No obstante, este documento muestra una hibridación competitiva, es decir una técnica en la que la diana y la cadena de la segunda sonda compiten para unirse a la cadena de la primera sonda. Como las dos cadenas de la sonda son de la misma longitud, el doblete de sondas de D6 no satisface el criterio que una de las cadenas de las sondas se une preferentemente a la diana por encima de la otra cadena de la sonda. D6 tampoco logra en describir que la temperatura de fusión del complejo de sondas debe ser de 5 a 10ºC superior que la temperatura de hibridación de una reacción de amplificación (PCR) .

Resumen de la invención En un primer aspecto, esta invención está relacionada con un método de seguimiento de la amplificación de ácidos nucleicos que comprende: la realización de la amplificación de un polinucleótido diana en la que la amplificación se lleva a cabo mediante cualquier método que utilice una primera sonda oligonucleotídica y una segunda sonda oligonucleotídica más corta en por lo menos dos pares de bases; la primera sonda presenta un fluoróforo; la segunda es complementaria de la primera sonda y presenta una molécula desactivadora capaz de desactivar la fluorescencia de dicho fluoróforo, estando este último y el desactivador unidos a sus sondas respectivas en una posición que provoca que la molécula desactivadora desactive la fluorescencia del fluoróforo cuando las sondas hibridan, caso en el que la sonda de mayor longitud se une preferentemente al polinucleótido diana y, cuando se encuentra en esta situación, la intensidad de fluorescencia del fluoróforo es mayor que la del fluoróforo cuando está hibridado con la segunda sonda; y el seguimiento de la fluorescencia del fluoróforo, siendo la generación de fluorescencia una consecuencia de la amplificación del ácido nucleico.

También está relacionada con un método de detección de la presencia de un polinucleótido diana mediante las sondas... [Seguir leyendo]

1. Un método de seguimiento de la amplificación de ácidos nucleicos que comprende lo siguiente:

llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos sobre un polinucleótido diana utilizando cualquier método, donde dicha amplificación se lleva utilizando una primera sonda oligonucleotídica, y

una segunda sonda oligonucleotídica con una molécula desactivadora capaz de desactivar la fluorescencia del fluoróforo mencionado,

en el que el fluoróforo y el desactivador están unidos a sus sondas respectivas en unas posiciones que resultan en la desactivación de la fluorescencia del fluoróforo mediante la molécula desactivadora cuando las dos sondas están hibridadas entre sí,

en el que la segunda sonda de oligonucleótido que es complementaria a la primera sonda de oligonucleótido, es al menos dos pares de bases más corta que la primera sonda de oligonucleótido, y en el que las sondas se seleccionan de forma que la Tm del complejo de la sonda de oligonucleótido es entre 5 y 10ºC superior a la temperatura de hibri

dación de la reacción de amplificación monitorizada, y

en el que la primera sonda de oligonucleótido se une preferentemente al ácido nucleico diana sobre la segunda sonda de oligonucleótido con el efecto que la fluorescencia del fluoróforo es superior cuando la primera sonda de oligonucleótido hibrida con el ácido nucleico diana que cuando hibrida con la segunda sonda de oligonucleótido, y

monitorizar la fluorescencia del fluoróforo, la generación de fluorescencia que corresponde a la presencia de ácidos nucleicos diana;

en el que el método de amplificación es la PCR.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el fluoróforo está en el nucleótido terminal 5' de la primera sonda y la molécula desactivadora está en el extremo terminal 3' de la segunda sonda.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fluoróforo se encuentra en el nucleótido terminal 3' 35 de la primera sonda y la molécula desactivadora está en el extremo terminal 5' de la segunda sonda.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la segunda sonda es complementaria de la primera sonda acortada por la deleción de tres o más nucleótidos 5' terminales.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la segunda sonda es complementaria de la primera sonda acortada por la deleción de tres o más nucleótidos 3' terminales.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la segunda sonda es complementaria de la primera sonda acortada por la deleción de tres o más nucleótidos 5' terminales y la deleción de uno o más nucleótidos 3' 45 terminales.