Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno.

Una composición que comprende:

un polipéptido con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapalipídica de membrana en forma de hélice transmembranal,

y secuencias que flanquean dicha secuencia hidrófoba demodo que el péptido es soluble en disoluciones acuosas y se inserta espontáneamente a través de una membranacelular en un pH de 7,4 o menor, moviéndose una de las regiones de secuencia flanqueadora a través de la membranacelular y quedando otra región de secuencia flanqueadora expuesta al ambiente acuoso, fuera de la célula, enque dichas secuencias flanqueadoras comprenden una FSin en el extremo C de dicho polipéptido y una FSout en elextremo N de dicho polipéptido; y uno o más grupos funcionales unidos a dicho extremo C o dicho extremo N dedicho polipéptido,

caracterizada por que el polipéptido comprende la secuencia Sec.1:

AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG.

Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

1. Campo del invento

El presente invento tiene relación con el campo de la bioquímica de proteínas, la biofísica de membranas, el suministro específico de fármacos, la regulación génica, la obtención de imágenes y el diagnóstico de tejidos enfermos. Más particularmente, el invento se refiere al uso de un polipéptido transmembranal para dirigir a células y tejidos con ambiente ácido.

2. Descripción de la técnica previa

Los compuestos terapéuticos y diagnósticos deben suministrarse al tejido enfermo y acumularse en él en concentraciones adecuadas para los fines terapéuticos o diagnósticos. El suministro específico de compuestos terapéuticos y diagnósticos a un tejido enfermo mejora significativamente la eficacia del tratamiento o la exactitud diagnóstica y reduce drásticamente los efectos secundarios. La hipoxia y la acidosis son marcadores fisiológicos de muchos procesos morbosos, tales como tumores, lesiones ateroscleróticas, isquemias, accidentes cerebrovasculares, inflamaciones y traumas (Stubbs et al., 2000, Mol. Med. Today 6, 15; Helmlinger et al., 2002, Clin. Cancer Res. 8, 1284; Izumi et al., 2003, Cancer Treat. Reviews 29, 541; Leake, 1997, Atherosclerosis 129, 149; Avkiran, 2003, J. Card. Surg. 18, 3) . El suministro de moléculas, selectivo en cuanto al pH, al tejido enfermo es otro objeto del presente invento.

En la mayoría de los casos, los compuestos terapéuticos y diagnósticos se deben translocar a una célula a través de la membrana celular con objeto de alcanzar sus dianas. También es necesario que muchos reactivos para la investigación de procesos celulares y la regulación génica se transloquen a células. La membrana plasmática, que está principalmente compuesta de fosfolípidos y proteínas, es una barrera natural para la libre difusión de moléculas a través de ella.

Las funciones transmembranales son mediadas por proteínas de membrana. La plegadura y la inserción de grandes dominios de proteínas de membrana en las membranas requieren normalmente la participación activa de máquinas de translocación complejas (van den Berg et al., 2004, Nature 427, 36; Osborne et al., 2005, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21, 529; White y von Heijne, 2005, Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 378) , mientras que la inserción y la plegadura de secuencias proteicas cortas (< 50-60 restos) pueden tener lugar espontáneamente (von Heijne, 1994, FEBS Lett. 346, 69; Whitley et al., 1994, EMBO J. 13, 4653; Wimley y White, 2000, Biochemistr y 39, 4432; Popot y Engelman, 1990, Biochemistr y 29, 4031) , liberándose energía y translocándose un extremo del polipéptido a la célula. En un trabajo reciente, se ha mostrado que ciertos casos de aparente inserción espontánea requieren una proteína de membrana, YidC [para una revisión, véase Dalbey y Kuhn, 2004, J. Cell. Biol. 166: 769) .

Previamente se había comunicado que un polipéptido derivado de la hélice C de la bacteriorrodopsina, que consiste en la secuencia transmembranal y dos secuencias flanqueadoras, es soluble en disolución acuosa y se inserta espontáneamente a través de las bicapas lipídicas, formando una hélice alfa estable en un pH bajo (Engelman y Hunt, 1998, Patente de EE.UU. nº 5.739.273; Hunt et al., 1997, Biochemistr y 36, 15.177) . El péptido no presenta ningún elemento de estructura secundaria helicoidal en disolución ni en la membrana en un pH neutro. Puesto que el péptido se inserta en vesículas lipídicas puras, puede que no necesite YidC. La translocación de moléculas, selectiva en cuanto al pH, a través de la membrana celular es otro objeto del presente invento.

SUMARIO DEL INVENTO

El presente invento proporciona un polipéptido de inserción en pH bajo [pHLIP (del inglés, pH Low Insertion Peptide) ], con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapa lipídica de membrana en forma de hélice transmembranal, y secuencias que flanquean dicha secuencia hidrófoba de modo que el polipéptido es soluble en disoluciones acuosas y se inserta espontáneamente a través de una membrana de un modo dependiente del pH, moviéndose una de las regiones FS (FSin) a través de la membrana hasta el citoplasma y quedando la otra (FSout) fuera de la célula, expuesta al ambiente acuoso, en que dichas secuencias flanqueadoras comprenden una FSin en el extremo C de dicho polipéptido y una FSout en el extremo N de dicho polipéptido; y uno o más grupos funcionales fijados a dicho extremo C o dicho extremo N de dicho polipéptido, caracterizado por que el polipéptido comprende la Sec1:

AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG.

El invento también proporciona un método para suministrar in vitro un grupo funcional a través de una membrana celular en un pH extracelular ácido, empleando una composición que comprende el polipéptido pHLIP, en que un grupo funcional está fijado al extremo C del polipéptido.

También se proporciona un método para suministrar in vitro un grupo funcional a superficies celulares en un pH extracelular ácido, empleando una composición que comprende el polipéptido pHLIP, en que un grupo funcional está fijado al extremo N del polipéptido.

En un pH extracelular bajo, el pHLIP puede translocar ciertos grupos funcionales conjugados con la parte FSin del polipéptido a través de la membrana. Si los grupos funcionales están unidos al pHLIP mediante interacciones que son lábiles en el ambiente del citoplasma, tales como enlaces disulfuro, el grupo funcional puede ser liberado en el citoplasma. Los ejemplos de moléculas que pueden ser translocadas y liberadas incluyen faloidina, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs; del inglés, peptide nucleic acids) y el colorante dansilo.

El pHLIP puede anclar un grupo funcional, conjugado con la parte FSout del polipéptido, a una membrana celular en un pH bajo, situándolo en la superficie externa de una célula. La situación en la superficie externa puede ser útil, por ejemplo, para estimular actividades de receptor, para formar una imagen de la situación de la célula marcada, o para suministrar moléculas tóxicas tales como la toxina diftérica para matar selectivamente células en regiones de bajo pH.

El pHLIP representa una nueva tecnología para un suministro rápido, selectivo y eficaz de grupos funcionales a células in vitro e in vivo.

Éstas y otras características del presente invento se describirán ahora con mayor detalle, con referencia a los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIGURA 1 es un diagrama esquemático del suministro de un grupo funcional a una célula mediante pHLIP (a) o del anclaje de un grupo funcional a la superficie de una célula diana mediante pHLIP (b) .

Las FIGURAS 2a y 2b son gráficos de tiempo frente a intensidad de fluorescencia, en que en (a) se añadió ditionito sódico a pHLIP con NBD sobre FSout, insertados en vesículas unilaminares grandes (LUVs; del inglés, large unilamellar vesicles) de POPC, y en (b) se añadieron LUVs de POPC que contenían dentro ion ditionito al NBD-péptido en un pH de 8, 0, disminuyendo luego la inserción del péptido en liposomas desencadenada por el pH, lo que ilustra el proceso de marcación de células en un pH bajo.

La FIGURA 3a muestra la estructura química covalente del colorante dansilo y la FIGURA 3b muestra imágenes de fluorescencia de células HeLa incubadas (durante 15 minutos) con una construcción escindible de pHLIP-S-Sdansilo (7 μM) en pHs de 5, 5, 6, 5, 7, 0 y 7, 4, y lavadas con tampón de PBS en un pH de 7, 4, en que el enlace S-S es con FSin, y el colorante es liberado en las células de un modo dependiente del pH.

La FIGURA 4a muestra la estructura química covalente de la faloidina y la FIGURA 4b muestra imágenes de fluorescencia de células HeLa incubadas (durante 15 minutos) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (4 μM) en un pH de 7, 4 (izquierda) y 6, 5 (derecha) , en que la faloidina está unida a FSin y es liberada en el citoplasma tras la inserción y la subsiguiente reducción del enlace disulfuro.

Las FIGURAS 5a-5d son gráficos de fluorescencia frente a cuentas de células no tratadas y células tratadas en suspensión (durante 1 hora) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (6 μM) en diferentes pHs y temperaturas, mostrando la marcación de células de un modo dependiente del pH que no es inhibida por una baja temperatura (4 °C) .

La FIGURA 6a muestra imágenes confocales de fluorescencia y campo claro de células de... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende:

un polipéptido con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapa lipídica de membrana en forma de hélice transmembranal, y secuencias que flanquean dicha secuencia hidrófoba de modo que el péptido es soluble en disoluciones acuosas y se inserta espontáneamente a través de una membrana celular en un pH de 7, 4 o menor, moviéndose una de las regiones de secuencia flanqueadora a través de la membrana celular y quedando otra región de secuencia flanqueadora expuesta al ambiente acuoso, fuera de la célula, en que dichas secuencias flanqueadoras comprenden una FSin en el extremo C de dicho polipéptido y una FSout en el extremo N de dicho polipéptido; y uno o más grupos funcionales unidos a dicho extremo C o dicho extremo N de dicho polipéptido,

caracterizada por que el polipéptido comprende la secuencia Sec.1:

AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG.

2. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 1, en que los aminoácidos de Sec 1 son L-aminoácidos, o uno o más de los aminoácidos especificados en Sec 1 son D-aminoácidos.

3. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es seleccionado de entre reactivos terapéuticos, diagnósticos, profilácticos, para obtención de imágenes, para regulación génica, para regulación de funciones celulares, apoptóticos y para investigación.

4. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es un ácido nucleico peptídico o un ácido nucleico.

5. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es seleccionado de entre: un fármaco, un virus, un polisacárido, un liposoma, y una partícula compuesta de cualquier material.

6. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es un antígeno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un elemento citotóxico.

7. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es escogido de entre faloidina, faloína, falisina, profaloína, falacina, falacidina y falisacina.

8. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es una enzima marcadora tal como una peroxidasa, una luciferasa o una fosfatasa alcalina.

9. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional o cada uno de dichos grupos funcionales está fijado por un enlace escindible o no escindible que comprende una secuencia seleccionada de entre un disulfuro, un péptido con motivo ligante de proteínas, una secuencia de consenso de proteína cinasa, una secuencia de consenso de proteína fosfatasa, una secuencia reactiva con proteasas, una secuencia reactiva con peptidasas, una secuencia reactiva con transferasas, una secuencia reactiva con hidrolasas, una secuencia reactiva con isomerasas, una secuencia reactiva con ligasas, una secuencia reactiva con metaloproteasas extracelulares, una secuencia reactiva con proteasas lisosómicas, una secuencia reactiva con beta-lactamasas, una secuencia reactiva con oxidorreductasas, una secuencia reactiva con esterasas, una secuencia reactiva con glicosidasas y una secuencia reactiva con nucleasas.

10. La composición de la Reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente terapéutico, diagnóstico, profiláctico, para obtención de imágenes, para activación de una reacción inmune, para regulación génica o para regulación de funciones celulares, o como una herramienta para investigación.

11. La composición de la Reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente para suministrar un grupo funcional, a través de membranas celulares, a células de un tejido enfermo con un ambiente extracelular ácido naturalmente producido o de un tejido con un ambiente extracelular ácido artificialmente provocado con respecto al pH fisiológico normal, en que el grupo funcional está unido al extremo C del polipéptido.

12. La composición de la Reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente para suministrar un grupo funcional a superficies celulares de un tejido enfermo con un ambiente extracelular ácido naturalmente producido o de un tejido con un ambiente extracelular ácido artificialmente provocado con respecto al pH fisiológico normal, en que el grupo funcional está unido al extremo N del polipéptido.

13. Un método para suministrar in vitro un grupo funcional a través de una membrana celular en un pH extracelular ácido, caracterizado por el uso de una composición de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo C del polipéptido.

14. Un método para suministrar in vitro un grupo funcional a superficies celulares en un pH extracelular ácido, caracterizado por el uso de una composición de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo N del polipéptido.

15. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo C del polipéptido,

para uso como un agente para suministrar un grupo funcional, a través de membranas celulares, a células de un tejido enfermo con un pH extracelular bajo, que es el resultado de un cáncer, un infarto, una lesión aterosclerótica, un trauma, una inflamación, un accidente cerebrovascular o una infección microbiana o fúngica.

16. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo N del polipéptido, para uso como un agente para suministrar un grupo funcional a las superficies de células de un tejido enfermo con un pH extracelular bajo, que es el resultado de un cáncer, un infarto, una lesión aterosclerótica, un trauma, una inflamación, un accidente cerebrovascular o una infección microbiana o fúngica.

17. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que dicho polipéptido comprende además un resto de Cys en dicho extremo N.

18. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que dicho polipéptido comprende un colorante fluorescente cova15 lentemente unido a un resto de Cys en dicho extremo N.

19. La composición de la Reivindicación 18, en que dicho colorante fluorescente comprende Cy5.5.

FIGURA 3a

FIGURA 3b

FIGURA 4a

FIGURA 4b

FIGURA 5

FIGURA 6

FIGURA 7

FIGURA 8

FIGURA 9

FIGURA 10

FIGURA 11

FIGURA 12

FIGURA 13

FIGURA 14