Molécula de ADN recombinante para expresar proteínas estructurales de alfavirus que comprende un promotor para dirigir la transcripción de ARN a partir de una secuencia de ADN ligada operativamente a una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificadora de poliproteína estructural de alfavirus completa,

con la condición de que la secuencia de ADN no codifique las secuencias de reconocimiento de replicación 5'' o 3'' alfavirales o un promotor subgenómico de alfavirus.

Sistemas vectores basados en replicones de alfavirus.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a métodos y a construcciones mejoradas para preparar partículas alfavirus recombinantes que son útiles en inmunoterapias para el cáncer y enfermedades infecciosas y en el suministro de genes con propósitos terapéuticos.

Antecedentes de la invención

En la actualidad, los alfavirus se usan como plataforma vectorial para desarrollar vacunas para enfermedades infecciosas (por ejemplo, véase las patentes estadounidenses Nos. 5.792.462, 6.156.558, 5.811.407, 5.789.245, 6.015.694, 5.739.026, Pushko et al., Virology 239 (2): 389-401 (1997), Frolov et al, J. Virol. 71(1): 248-258 (1997); Smerdou and Liljestrom, J. Virol. 73(2): 1092-1098 (1999). Los alfavirus comprenden un género en la familia Togaviridae, y los miembros del género se encuentran a lo largo de toda la Tierra, tanto en huéspedes vertebrados como en invertebrados. Entre los alfavirus más estudiados para plataformas vectoriales se encuentran el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus de la selva de Semliki (SFV) y el virus Sindbis, el miembro prototipo del género. Se han desarrollado varias construcciones para mejorar la inmunogenicidad y efectividad en aplicaciones de vacunas. Muchas de estas construcciones han sido diseñadas también para reducir la probabilidad de formación de virus con capacidad de replicación mediante recombinación. Johnston et al. (patentes estadounidenses Nos. 5.792.462 y 6.156.558, citadas anteriormente), reconocieron el potencial para la recombinación partiendo de un sistema auxiliar único (en el que el conjunto completo de proteínas estructurales de un alfavirus están en una molécula de ARN y las proteínas no estructurales y el gen de interés están en otra molécula), y de esta manera diseñó sistemas "doble auxiliar" que utilizaban dos ARN auxiliares para codificar las proteínas estructurales. Dubensky et al. (patente estadounidense No. 5.789.245) y Polo et al. (patente estadounidense No. 6.242.259) describen el uso de dos cartuchos de expresión de ADN de proteínas estructurales de alfavirus para empaquetar replicones de alfavirus u otros vectores de alfavirus. Liljestroom y colaboradores han presentado datos que confirman que un "sistema auxiliar único" generará partículas víricas de tipo salvaje mediante recombinación (Bergland, et al. 1993 Biotechnology 11(8): 916-920)).

Distribuyendo los genes víricos entre tres ácidos nucleicos, dos de los cuales comprenden el sistema auxiliar, tal como en la técnica descrita anteriormente, la frecuencia de recombinación teórica de creación de un virus con capacidad de replicación se reduce considerablemente respecto a los sistemas de auxiliar único. Estos sistemas existentes incluyen el uso de las señales de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus, de manera que los sistemas auxiliares pueden aprovecharse de la presencia de la maquinaria de replicación del alfavirus para la amplificación y expresión eficiente de las funciones auxiliares. Sin embargo, la presencia de las señales de reconocimiento de terminación en los ARN auxiliares significa también que los recombinantes en los que las construcciones auxiliares se incorporan al final del ARN replicón mediante recombinación de ARN permanecen replicables. Se reconoce también (por ejemplo, Liljestrom et al. patente estadounidense No. 6.190.666, columna 17, líneas 45-48) que la región de unión a cápside de nsP1 es necesaria para el empaquetamiento del ARN alfavírico en un virus o una partícula de tipo vírica, y de esta manera la retirada de esta región resultaría en la reducción del empaquetamiento (véase también Levis et al. 1986 Cell 44:137 y Weiss et al. 1989 J. Virol. 63:530).

De esta manera, en los sistemas replicón existentes, las señales de empaquetamiento conocidas se incluyen típicamente en los ARN replicones y se excluyen de las construcciones auxiliares. Sin embargo, aún así los ARN auxiliares son empaquetados o coempaquetados a una frecuencia inferior (Lu and Silver (J. Virol Methods 2001, 91(1): 59-65)), y las construcciones auxiliares con señales de reconocimiento terminales serán amplificadas y expresadas en presencia de un replicón, y proporcionarán potencialmente eventos de recombinación adicionales.

Las dosificaciones preferentes actuales para la administración de partículas replicón vectoriales, tal como se describe en Johnston et al., o partículas alfavirus recombinantes, tal como se describe en Dubensky et al., son aproximadamente de 10⁶ a 10⁸ partículas. En el caso de administraciones a chimpancés, Dubensky et al. han estimado la necesidad de 4 inyecciones, conteniendo cada una 10⁷-10⁸ partículas, con una vacuna Sindbis-HBV. Dichas dosificaciones requieren procedimientos de fabricación a gran escala, y las cantidades producidas a dicha escala pueden ser mayores que la frecuencia predicha para la generación de virus con capacidad de replicación en estos sistemas existentes.

De esta manera, permanece una necesidad de mejorar adicionalmente los sistemas para preparar partículas replicón de alfavirus para reducir adicionalmente la frecuencia predicha de formación de virus con capacidad de replicación, y para optimizar los costos y las estrategias de preparación.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona sistemas vectores basados en replicón de alfavirus mejorados para producir partículas replicón de alfavirus infecciosas, sin capacidad de replicación en células permisivas a alfavirus. Están incluidos en el alcance de la invención los ARN replicones mejorados y los ácidos nucleicos auxiliares mejorados para expresar las proteínas estructurales de alfavirus. Durante la producción de partículas alfavirus recombinantes, la generación de partículas víricas con capacidad de replicación puede ocurrir mediante solo recombinación o mediante una combinación de empaquetamiento y recombinación de auxiliar. De esta manera, se proporcionan construcciones que eliminan o minimizan la ocurrencia de uno o de ambos de estos eventos. Además, estas construcciones están diseñadas también para minimizar los costos y la complejidad de fabricación de las partículas preparadas con dichas construcciones. La invención proporciona también métodos para preparar partículas alfavirus recombinantes usando las construcciones reivindicadas, y composiciones farmacéuticas que comprenden estas partículas alfavirus recombinantes.

En un primer aspecto, se proporciona una molécula de ADN recombinante para expresar las proteínas estructurales de alfavirus que comprende un promotor para dirigir la transcripción de ARN a partir de una secuencia de ADN ligada operativamente a una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificadora completa de poliproteína estructural de alfavirus, con la condición de que la secuencia de ADN no codifique las secuencias de reconocimiento de replicación 5' ó 3' alfavirales o un promotor subgenómico de alfavirus.

Un segundo aspecto de la invención proporciona métodos para producir partículas replicón de alfavirus infecciosas, sin capacidad de replicación, que comprenden introducir en una población de células (i) la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1; y (ii) un ARN replicón de alfavirus que codifica al menos un ARN heterólogo, bajo condiciones mediante las cuales se producen partículas infecciosas sin capacidad de replicación.

En un tercer aspecto de la invención, se proporcionan métodos para producir partículas replicón de alfavirus infecciosas, sin capacidad de replicación, que comprenden introducir en un población de células uno o más ácidos nucleicos auxiliares seleccionados de entre el grupo que comprende ADN auxiliares no replicantes, tal como se ha descrito anteriormente, y un ARN replicón de alfavirus que codifica al menos un ARN heterólogo, de manera que los auxiliares expresan todas las proteínas estructurales de alfavirus, bajo condiciones mediante las cuales se producen partículas replicón de alfavirus infecciosas y sin capacidad de replicación.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona células auxiliares para producir partículas alfavirus infecciosas, sin capacidad de replicación, utilizando cualquier combinación de los auxiliares divulgados en la presente memoria comprendiendo, en una célula permisiva a alfavirus, (i) una o más moléculas de ácido... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN recombinante para expresar proteínas estructurales de alfavirus que comprende un promotor para dirigir la transcripción de ARN a partir de una secuencia de ADN ligada operativamente a una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificadora de poliproteína estructural de alfavirus completa, con la condición de que la secuencia de ADN no codifique las secuencias de reconocimiento de replicación 5' o 3' alfavirales o un promotor subgenómico de alfavirus.

2. La molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, en la que las proteínas estructurales de alfavirus son seleccionadas de entre el grupo que comprende proteínas estructurales de VEE, Sindbis, S.A.AR 86, virus de la selva de Semliki y virus del río Ross.

3. La molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, en la que la secuencia codificadora de poliproteína estructural de alfavirus comprende una o más mutaciones atenuantes.

4. Célula auxiliar que produce una partícula replicón de alfavirus infecciosa y sin capacidad de replicación que comprende, en una célula permisiva a alfavirus,

5. Método de producción de partículas replicón de alfavirus infecciosas y sin capacidad de replicación, que comprende introducir en una población de células (i) la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, 2, ó 3; y (ii) un ARN replicón de alfavirus que codifica al menos un ARN heterólogo, bajo condiciones en las que se producen partículas replicón de alfavirus infecciosas y sin capacidad de replicación.

6. El método según la reivindicación 5, en el que la molécula de ADN recombinante y/o el ARN replicón son introducidos en la población de células mediante electroporación.

7. Método de producción de partículas replicón de alfavirus infecciosas y sin capacidad de replicación, que comprende introducir en una población de células,

8. El método según la reivindicación 7, en el que la proteína estructural de alfavirus de una o más moléculas de ADN recombinante de (i) es seleccionada de entre el grupo que comprende una proteína estructural de VEE, Sindbis, S.A.AR 86, virus de la selva de Semliki y virus del río Ross.

9. El método según la reivindicación 7, en el que la proteína estructural de alfavirus de una o más moléculas de ADN recombinante de (ii) es seleccionada de entre el grupo que comprende proteína estructural de VEE, Sindbis, S.A.AR 86, virus de la selva de Semliki y virus del río Ross.

10. El método según la reivindicación 7, en el que la secuencia codificadora de proteína estructural de alfavirus de la una o más moléculas de ADN recombinante de (i) y/o la una o más moléculas de ADN recombinante de (ii) comprenden una o más mutaciones atenuantes.

11. El método según la reivindicación 7, en el que la una o más moléculas de ADN recombinante de (i) y la una o más moléculas de ADN recombinante de (ii) son introducidas en la población de células mediante electroporación.