Sistemas y procedimientos para determinar una concentración de un analito sustancialmente independiente del hematocrito.

Un procedimiento para determinar una concentración de un analito sustancialmente independiente del hematocritoen una muestra de fluido depositada en una tira (90) de ensayo que tiene un electrodo (12) de trabajo y un electrodo(10) de referencia,

en el que el electrodo de trabajo está revestido con una capa (22) de reactivo, comprendiendo elprocedimiento:

aplicar una muestra de fluido a la tira de ensayo durante un periodo de reacción (tR);

aplicar un primer voltaje de ensayo (Vi) al electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un primervalor de corriente (I1) entre los mismos, siendo el primer voltaje de ensayo un valor absoluto deaproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios;

aplicar un primer voltaje de reposo (VR1) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo,comprendiendo el primer voltaje de reposo un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente50 milivoltios;

aplicar un segundo voltaje de ensayo (V2) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir unsegundo valor de corriente (I2), en el que el segundo voltaje de ensayo comprende un valor absoluto deaproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios;

aplicar un segundo voltaje de reposo (V2R) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, en el queel segundo voltaje de reposo comprende un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50milivoltios;

aplicar un tercer voltaje de ensayo (V3) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir untercer valor de corriente (I3), en el que el tercer voltaje de ensayo comprende un valor absoluto deaproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; y

calcular la concentración del analito sustancialmente independiente del hematocrito a partir del primer,segundo y tercer valores de corriente.

Sistemas y procedimientos para determinar una concentración de un analito sustancialmente independiente del hematocrito

1. Prioridad

La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad a tenor de 35 U.S.C. §119 de la solicitud provisional S.N. 60/850.211 presentada el 5 de octubre de 2006, titulada “Systems And Methods For Determining A Substantially Hematocrit Independent Analyte Concentration, ” solicitud que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

2. Descripción de la técnica relacionada El documento WO 03/097860 trata sobre un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un microelectrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador oxidación-reducción que es capaz de convertirse por oxidación o reducción por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, permitiendo al analito reaccionar con la enzima, y después aplicar un potencial a través del electrodo y medir la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente.

Las tiras de ensayo de glucosa electroquímicas, tales como las que se usan en el kit de ensayo de sangre completa One Touch® Ultra®, que están disponibles en LifeScan, Inc., están diseñadas para medir la concentración de glucosa en una muestra de sangre de pacientes con diabetes. La medición de la glucosa se basa en la oxidación específica de la glucosa por la flavoenzima glucosa oxidasa. Las reacciones que pueden tener lugar en una tira de ensayo de glucosa se resumen a continuación en las Ecuaciones 1 y 2.

D-Glucosa + GO (ox) º Acido Gluconico + GO (red) (1)

GO (red) + 2 Fe (CN) 63-º GO (ox) + 2 Fe (CN) 64- (2)

Como se muestra en la Ecuación 1, la glucosa se oxida a ácido glucónico por acción de la forma oxidada de la glucosa oxidasa (GO (ox) ) . Se debe señalar que GO (ox) también puede denominarse “enzima oxidada”. Durante la reacción de la Ecuación 1, la enzima oxidada GO (ox) se convierte en su estado reducido, lo que se representa como GO (red) (es decir, “enzima reducida”) . A continuación, la enzima reducida GO (red) se reoxida de nuevo a GO (ox) por reacción con Fe (CN) 63- (denominado mediador oxidado o ferricianuro) como se muestra en la Ecuación 2. Durante la reoxidación de GO (red) a su estado oxidado GO (ox) , Fe (CN) 63- se reduce a Fe (CN) 64- (denominado mediador reducido o ferrocianuro) .

Cuando las reacciones expuestas anteriormente se realizan con un voltaje de ensayo aplicado entre dos electrodos, se puede crear una corriente de ensayo por la reoxidación electroquímica del mediador reducido en la superficie del electrodo. De esta manera, como en un entorno ideal, la cantidad de ferricianuro creada durante la reacción química descrita anteriormente es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra situada entre los electrodos, la corriente de ensayo generada sería proporcional al contenido de glucosa de la muestra. Un mediador, tal como el ferricianuro, es un compuesto que acepta electrones de una enzima tal como la glucosa oxidasa y después dona los electrones a un electrodo. Según se incrementa la concentración de glucosa en la muestra, la cantidad de mediador reducido que se forma también se incrementa, por tanto, hay una relación directa entre la corriente de ensayo resultante de la reoxidación del mediador reducido y la concentración de glucosa. En particular, la transferencia de electrones a través de la interfase eléctrica da lugar a un flujo de corriente de ensayo (2 moles de electrones por cada mol de glucosa que se oxida) . La corriente de ensayo que resulta de la introducción de glucosa se puede denominar, por tanto, corriente de glucosa.

Debido a que puede ser muy importante conocer la concentración de glucosa en la sangre, particularmente para las personas con diabetes, se han desarrollado sistemas de medición que usan los principios expuestos anteriormente para permitir a una persona normal recoger una muestra y comprobar su sangre para determinar la concentración de glucosa en cualquier momento dado. La corriente de glucosa generada se monitoriza por los sistemas de medición y se convierte en una lectura de la concentración de glucosa usando un algoritmo que relaciona la corriente de ensayo con una concentración de glucosa por medio de una fórmula matemática sencilla. En general, los sistemas de medición funcionan en conjunto con una tira de ensayo desechable que incluye una cámara de recepción de la muestra y al menos dos electrodos colocados en la cámara de recepción de muestra además de la enzima (por ejemplo, glucosa oxidasa) y el mediador (por ejemplo, ferricianuro) . En cuanto a su utilización, el usuario se pincha un dedo u otro sitio conveniente para inducir el sangrado e introduce una muestra de sangre en la cámara de recepción de la muestra, iniciándose de esta manera la reacción química expresada anteriormente.

En términos electroquímicos, la función del medidor es doble. Primero, proporciona un voltaje polarizante (aproximadamente de 0, 4 V en el caso de One Touch® Ultra®) que polariza la interfase eléctrica y permite el flujo de corriente en la superficie de carbono del electrodo de trabajo. Segundo, mide la corriente que fluye en el circuito externo entre el ánodo (electrodo de trabajo) y el cátodo (electrodo de referencia) . Por lo tanto, puede considerarse que el medidor de ensayo es un sistema electroquímico simple que funciona en modo de dos electrodos aunque, en la práctica, puede usarse un tercero o incluso un cuarto electrodo para facilitar la medición de la glucosa y/o llevar a cabo otras funciones del medidor del ensayo.

En la mayoría de las situaciones, la ecuación expuesta anteriormente se considera una aproximación suficiente de la reacción química que tiene lugar en la tira de ensayo y en el sistema de medición del ensayo que proporciona una representación suficientemente precisa del contenido en glucosa de la muestra de sangre. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias y para ciertos propósitos, puede ser ventajoso mejorar la precisión de la medición. Por ejemplo, las muestras de sangre que tienen un nivel alto o bajo del hematocrito pueden hacer que una medición de la glucosa sea imprecisa.

Un nivel de hematocrito representa un porcentaje del volumen de una muestra de sangre completa ocupado por glóbulos rojos. El nivel de hematocrito también puede representarse como una fracción de los glóbulos rojos presentes en una muestra de sangre completa. En general, una muestra de sangre con un hematocrito alto es más viscosa (hasta aproximadamente 10 centipoise a un hematocrito del 70%) que una muestra de sangre con un hematocrito bajo (aproximadamente 3 centipoise a un hematocrito del 20%) . Además, una muestra de sangre con un hematocrito alto tiene un contenido mayor de oxígeno que la sangre con hematocrito bajo debido al incremento concomitante de hemoglobina, que es un vehículo para el oxígeno. Por tanto, el nivel de hematocrito puede tener influencia sobre la viscosidad y el contenido de oxígeno de la sangre. Como se describirá más adelante, tanto la viscosidad como el contenido de oxígeno pueden cambiar la magnitud de la corriente de glucosa y, a su vez, hacer que la concentración de glucosa sea imprecisa.

Una muestra con viscosidad alta (es decir, una muestra de sangre con hematocrito alto) puede ocasionar que la corriente de ensayo disminuya por varios factores tales como un descenso en 1) la tasa de disolución de la enzima y/o el mediador, 2) la tasa de reacción de la enzima, y 3) la difusión de un mediador reducido hacia el electrodo de trabajo. Un descenso de la corriente que no está basado en un descenso de la concentración de glucosa puede potencialmente causar una imprecisión en la concentración de glucosa que se tiene que medir.

Una tasa de disolución más lenta de la capa de reactivo puede ralentizar la reacción enzimática que se ilustra en las Ecuaciones 1 y 2 debido a que la enzima oxidada GO (ox) debe disolverse primero antes de que pueda reaccionar con la glucosa. De forma similar, el ferricianuro (Fe (CN) 63-) debe disolverse primero antes de que pueda reaccionar con la enzima reducida GO (red) . Si la enzima oxidada no disuelta GO (ox) no puede oxidar la glucosa, entonces la enzima reducida GO (red) no puede producir el mediador reducido Fe (CN) 64- necesario para generar la corriente de ensayo. Además, la enzima oxidada GO (ox) reaccionará con la glucosa y el mediador oxidado Fe (CN) 63- más lentamente si está en una muestra con viscosidad alta que si está en una muestra con viscosidad baja. La tasa más lenta de reacción en las muestras con... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar una concentración de un analito sustancialmente independiente del hematocrito en una muestra de fluido depositada en una tira (90) de ensayo que tiene un electrodo (12) de trabajo y un electrodo (10) de referencia, en el que el electrodo de trabajo está revestido con una capa (22) de reactivo, comprendiendo el 5 procedimiento:

aplicar una muestra de fluido a la tira de ensayo durante un periodo de reacción (tR) ; aplicar un primer voltaje de ensayo (Vi) al electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un primer valor de corriente (I1) entre los mismos, siendo el primer voltaje de ensayo un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios;

aplicar un primer voltaje de reposo (VR1) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, comprendiendo el primer voltaje de reposo un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50 milivoltios; aplicar un segundo voltaje de ensayo (V2) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un segundo valor de corriente (I2) , en el que el segundo voltaje de ensayo comprende un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; aplicar un segundo voltaje de reposo (V2R) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, en el que el segundo voltaje de reposo comprende un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50 milivoltios; aplicar un tercer voltaje de ensayo (V3) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un tercer valor de corriente (I3) , en el que el tercer voltaje de ensayo comprende un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; y calcular la concentración del analito sustancialmente independiente del hematocrito a partir del primer, segundo y tercer valores de corriente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:

calcular una fracción del hematocrito (h) utilizando la siguiente ecuación:

donde:

h es la fracción de glóbulos rojos en una muestra de sangre completa; h0 es la fracción de glóbulos rojos en una muestra de sangre completa de un paciente normal; E es un valor de corriente sustancialmente dependiente del hematocrito; I0 es un valor de corriente sustancialmente independiente del hematocrito;

y

k, m2, m3, c2 y c3 son parámetros obtenidos por regresión lineal de los datos experimentales.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el cálculo comprende calcular la concentración del analito sustancialmente independiente del hematocrito a partir de la intersección en y de un gráfico que representa log10 (Ii)

frente a log10 (tiempo) ; donde:

Ii es el valor de corriente medido cerca del final de cada voltaje de ensayo e i varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 3; y tiempo es el tiempo al que se mide Ii 4. Un sistema de medición de analito que comprende:

una tira (90) de ensayo que comprende un electrodo (10) de referencia y un electrodo (12, 14) de trabajo, en el que el electrodo de trabajo está revestido con una capa (22) de reactivo; y un medidor de ensayo (100) que comprende: un circuito electrónico que aplica una pluralidad de voltajes al electrodo de referencia y al electrodo de trabajo con sus duraciones respectivas; y un procesador (192) de señal configurado para determinar una concentración de analito sustancialmente independiente del hematocrito a partir de una pluralidad de valores de corriente (Ii) medidos por el procesador tras la aplicación de una pluralidad de voltajes de ensayo (Vi) a los electrodos de referencia y de trabajo con una pluralidad de duraciones intercalados con voltajes de reposo (VRi) más bajos que los voltajes de ensayo que se aplican a los electrodos.

5. El sistema de la reivindicación 4, en el que la concentración del analito sustancialmente independiente del hematocrito se calcula a partir de la intersección en y de un gráfico que representa el log10 (Ii) frente al log10 (tiempo) ;

Ii es el valor de corriente medido cerca del final de cada uno del primer, segundo y tercer voltajes de ensayo e i varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 3; y tiempo es el tiempo al que se mide Ii.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2 o el sistema de la reivindicación 4, en el que las duraciones del primer, segundo y tercer voltajes de ensayo son iguales, y varían de aproximadamente 0, 1 a aproximadamente 1, 0 segundos; las duraciones del primer y segundo voltajes de reposo son iguales y varían de aproximadamente 0, 05 a aproximadamente 1, 0 segundos; el primer, segundo y tercer valores de corriente se miden aproximadamente 0, 1 a aproximadamente 1, 0 segundos después de aplicar un voltaje de ensayo a la tira de ensayo; las magnitudes del primer, segundo y tercer voltajes de ensayo son iguales y es una de aproximadamente 200 milivoltios o aproximadamente 400 milivoltios; y el periodo de reacción comprende de aproximadamente cero segundos a aproximadamente cinco segundos.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 o el sistema de la reivindicación 4, en el que la capa de reactivo comprende una enzima, un mediador y una solución tampón, en el que el mediador es cloruro de rutenio hexamina.

8. El sistema de la reivindicación 4, en el que el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo comprenden oro o carbono.

9. El sistema de la reivindicación 7, en el que el medidor además comprende una pantalla (102) que comprende:

una sección (110) para mostrar una concentración del analito; un indicador de intervalos (114) para indicar si la concentración del analito está dentro de un intervalo normal; y un elemento gráfico (118) para apuntar desde la dirección general de la concentración del analito a una región en el indicador de intervalos en la que cae la concentración del analito, comprendiendo el indicador de intervalos una pluralidad de intervalos representados como un continuo.

10. El procedimiento de la reivindicación 1 o el sistema de la reivindicación 4, en el que el electrodo de trabajo comprende una pluralidad de microelectrodos formados con oro.

11. Un procedimiento para comprobar la funcionalidad de una tira (90) de ensayo que tiene un electrodo (10) de referencia y un electrodo (12) de trabajo con el electrodo de trabajo revestido con una capa (22) de reactivo, comprendiendo el procedimiento:

aplicar una muestra de fluido a la tira de ensayo durante un periodo de reacción (tR) ; aplicar un primer voltaje de ensayo (V2) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un primer valor de corriente (I1) , en el que el primer voltaje de ensayo es un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; aplicar un primer voltaje de reposo (VR1) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, siendo el primer voltaje de reposo un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50 milivoltios; aplicar un segundo voltaje de ensayo (V2) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un segundo valor de corriente (I2) , en el que el segundo voltaje de ensayo es un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; aplicar un segundo voltaje de reposo (VR2) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, en el que el segundo voltaje de reposo es un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50 milivoltios; aplicar un tercer voltaje de ensayo (V3) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un tercer valor de corriente (I3) , en el que el tercer voltaje de ensayo es un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; aplicar un tercer voltaje de reposo (VR3) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, en el que el tercer voltaje de reposo es un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50 milivoltios; aplicar un cuarto voltaje de ensayo (V4) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un cuarto valor de corriente (I4) , en el que el cuarto voltaje de ensayo es un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; aplicar un cuarto voltaje de reposo (VR4) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, en el que el cuarto voltaje de reposo es un valor absoluto de aproximadamente cero a aproximadamente 50 milivoltios; aplicar un quinto voltaje de ensayo (V5) entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un quinto valor de corriente (I5) , en el que el quinto voltaje de ensayo es un valor absoluto de aproximadamente 100 milivoltios a aproximadamente 600 milivoltios; generar una curva que represente el primer, segundo, tercer, cuarto y quinto valores de corriente como una función del tiempo de pulso, en el que el tiempo de pulso se mide en relación al inicio del primer voltaje de ensayo; usar regresión de mínimos cuadrados para ajustar la curva a la siguiente ecuación:

donde:

Ii es el valor de corriente medido al final de cada voltaje de ensayo obtenido en el tiempo de pulso ti en el que i varía de 1 a 5; 'i es un término de interferencia;

es el primer parámetro de forma definido por la siguiente ecuación:

donde:

;

es el segundo parámetro de forma definido por la siguiente ecuación:

donde:

calcular un valor de I y e para cada tiempo de pulso y guardar los valores de I y e en una tabla de consulta en el sistema de medición; calcular un valor de y un valor de usando los 5 valores de corrientes y los valores de I y e de la tabla de consulta para obtener un mejor ajuste a la curva; y calcular una relación de

a para la tira de ensayo y comparar la relación de

a en un intervalo de 30 aceptación para una tira de ensayo que funciona normalmente.