Sistemas de policétido sintasa de AGPI y usos de los mismos.

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 y fragmentos biológicamente activos de las mismas, en la que los fragmentos biológicamente activos presentan una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad b-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH);

b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 70% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 66, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad b-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH);

c) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 68, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad b-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH); y

d) una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de (a), (b) o (c).

Sistemas de policétido sintasa de AGPI y usos de los mismos

Campo de la invención Esta invención se refiere a sistemas de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) de microorganismos, incluyendo organismos eucariotas, tales como traustoquitridios. Más particularmente, esta invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican para sistemas de PKS de AGPI no bacterianos, a sistemas de PKS de AGPI no bacterianos, a organismos modificados genéticamente que comprenden sistemas de PKS de AGPI no bacterianos y a métodos de obtención y uso de los sistemas de PKS de AGPI no bacterianos dados a conocer en el presente documento. Esta invención también se refiere a microorganismos modificados genéticamente y a métodos para producir eficazmente lípidos (triacilgliceroles (TAG) , así como fosfolípidos (PL) asociados a membrana) enriquecidos en diversos ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) y particularmente, ácido eicosapentanoico (C20:5, ω-3; EPA) mediante la manipulación de un sistema de policétido sintasa (PKS) de AGPI.

Antecedentes de la invención Los sistemas de policétido sintasa (PKS) se conocen generalmente en la técnica como complejos enzimáticos derivados de sistemas de ácido graso sintasa (FAS) , pero que a menudo se modifican enormemente para producir productos especializados que normalmente muestran poca semejanza con los ácidos grasos. Ahora se ha mostrado, sin embargo, que existen sistemas de policétido en bacterias marinas y determinadas microalgas que pueden sintetizar AGPI a partir de malonil-CoA. Las rutas de PKS para la síntesis de AGPI en Shewanella y otras bacterias marinas, Vibrio marinus, se describen en detalle en la patente estadounidense nº 6.140.486. Las rutas de PKS para la síntesis de AGPI en el traustoquitridio eucariota, Schizochytrium se describen en detalle en la patente estadounidense 6.566.583. Finalmente, las rutas de PKS para la síntesis de AGPI en eucariotas tales como miembros de Thraustochytriales, incluyendo la descripción estructural completa de la ruta de PKS de AGPI en Schizochytrium y la identificación de la ruta de PKS de AGPI en Thraustochytrium, incluyendo detalles respecto a los usos de estas rutas, se describen en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense nº 20020194641, publicada el 19 de diciembre de 2002 (que corresponde a la solicitud de patente estadounidense con nº de serie 10/124.800, presentada el 16 de abril de 2002) .

Los investigadores han intentado aprovecharse de los sistemas de policétido sintasa (PKS) que se han descrito en la bibliografía que se clasifican en uno de tres tipos básicos, denominados normalmente: tipo II, tipo I y modular. El

sistema de tipo II se caracteriza por proteínas separables, cada una de las cuales lleva a cabo una reacción enzimática distinta. Las enzimas actúan conjuntamente para producir el producto final y cada enzima individual del sistema participa normalmente varias veces en la producción del producto final. Este tipo de sistema funciona de manera análoga a los sistemas de ácido graso sintasa (FAS) hallados en plantas y bacterias. Los sistemas de PKS de tipo I son similares al sistema tipo II en que las enzimas se usan de modo iterativo para producir el producto final. El tipo I difiere del tipo II en que las actividades enzimáticas, en lugar de estar asociadas con proteínas separables, se producen como dominios de proteínas más grandes. Este sistema es análogo al sistema de FAS de tipo I encontrado en animales y hongos.

A diferencia de los sistemas de tipo I y II, en los sistemas de PKS modulares, cada dominio enzimático se usa sólo 45 una vez en la producción del producto final. Los dominios se encuentran en proteínas muy grandes y el producto de cada reacción se hace pasar a otro dominio en la proteína PKS. Adicionalmente, en todos los sistemas de PKS descritos anteriormente, si se incorpora un doble enlace carbono-carbono en el producto final, siempre es en la configuración trans.

En los sistemas de PKS de tipo I y tipo II descritos anteriormente, se lleva a cabo el mismo conjunto de reacciones en cada ciclo hasta que se obtiene el producto final. No se permite la introducción de reacciones únicas durante el procedimiento biosintético. Los sistemas de PKS modulares requieren proteínas enormes que no utilizan la economía de reacciones iterativas (es decir, se requiere un dominio distinto para cada reacción) . Adicionalmente, tal como se estableció anteriormente, se introducen dobles enlaces carbono-carbono en la configuración trans en todos 55 los sistemas de PKS descritos anteriormente.

Los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) son componentes críticos de los lípidos de membrana en la mayoría de los eucariotas (Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40 1 (2001) ; McConn et al., Plant J. 15, 521 (1998) ) y son precursores de determinadas hormonas y moléculas de señalización (Heller et al., Drugs 55, 487 (1998) ; Creelman et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355 (1997) ) . Las rutas de síntesis de AGPI conocidas implican el procesamiento de ácidos grasos saturados 16:0 o 18:0 (la abreviatura X:Y indica un grupo acilo que contiene X átomos de carbono e Y dobles enlaces (habitualmente cis en AGPI) ; las posiciones de doble enlace de AGPI se indican en relación con el carbono de metilo de la cadena de ácido graso (ω3º ω6) con interrupción de metileno sistemática de los dobles enlaces) derivado de la ácido graso sintasa (FAS) mediante reacciones de elongación y 65 desaturación aerobia (Sprecher, Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2, 135 (1999) ; Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8284 (2000) ; Shanklin et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Nol. Biol. 49, 611 (1998) ) . Partiendo

del acetil-CoA, la síntesis de ácido docosahexanoico (DHA) requiere aproximadamente 30 actividades enzimáticas distintas y casi 70 reacciones incluyendo las cuatro etapas repetitivas del ciclo de síntesis de ácidos grasos. Las policétido sintasas (PKS) llevan a cabo algunas de las mismas reacciones que FAS (Hopwood et al., Annu. Rev. Genet. 24, 37 (1990) ; Bentley et al., Annu. Rev. Microbiol. 53, 411 (1999) ) y usan la misma proteína pequeña (o dominio) , la proteína transportadora de acilo (ACP) , como sitio de unión covalente para la cadena carbonada en crecimiento. Sin embargo, en estos sistemas enzimáticos, el ciclo completo de reducción, deshidratación y reducción observado en FAS a menudo está abreviado, de modo que se produce una cadena carbonada altamente derivatizada, que contiene normalmente muchos grupos ceto e hidroxilo, así como dobles enlaces carbono-carbono en la configuración trans. Los productos lineales de PKS a menudo se ciclan para formar productos bioquímicos complejos que incluyen antibióticos y muchos otros productos secundarios (Hopwood et al., (1990) citado anteriormente; Bentley et al., (1999) , citado anteriormente; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598 (1999) ) .

Se han notificado AGPI de cadena muy larga, tales como el ácido docosahexanoico (DHA; 22:6ω3) y el ácido eicosapentanoico (EPA; 20:5ω3) de varias especies de bacterias marinas, incluyendo Shewanella sp (Nichols et al., 15 Curr. Op. Biotechnol. 10, 240 (1999) ; Yazawa, Lipids 31, S (1996) ; DeLong et al., Appl. Environ. Microbiol. 51, 730 (1986) ) . El análisis de un fragmento genómico (clonado como plásmido pEPA) de Shewanella sp. cepa SCRC2738 condujo a la identificación de cinco marcos de lectura abiertos (Orf) , totalizando 20 Kb, que son necesarios y suficientes para la producción de EPA en E. coli (Yazawa, (1996) , citado anteriormente) . Varios de los dominios de proteína predichos eran homólogos de enzimas FAS, mientras que otras regiones no mostraron homología con proteínas de función conocida. Al menos 11 regiones dentro de cinco Orf fueron identificables como supuestos dominios enzimáticos (véase Metz et al., Science 293:290-293 (2001) ) . Cuando se compararon con secuencias en las bases de datos de genes, siete de ellas estaban más fuertemente relacionadas con proteínas PKS que con proteínas FAS. En este grupo se incluían dominios que codifican supuestamente para malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT) , β-cetoacil-ACP sintasa (KS) , β-cetoacil-ACP reductasa (KR) , aciltransferasa (AT) ,

fosfopanteteína transferasa, factor de longitud de cadena (CLF) (o iniciación de cadena) y una agrupación altamente inusual de seis dominios ACP (es decir, la presencia de más de dos dominios ACP agrupados no se había notificado anteriormente en secuencias de PKS o FAS) . Es probable que la ruta de PKS para la síntesis de AGPI que se ha identificado en Shewanella esté extendida en bacterias marinas. Se han identificado genes con alta homología... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 y fragmentos biológicamente activos de las mismas, en la que los fragmentos biológicamente activos presentan una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ;

b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 70% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 66, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ;

c) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 68, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ; y

d) una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de (a) ,

(b) o (c) .

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos expuesta en b) .

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en b) o c) .

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 67.

5. Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquier reivindicación anterior, unida operativamente a al menos una secuencia de control de la transcripción.

6. Célula recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 5.

7. Microorganismo modificado genéticamente, en el que el microorganismo expresa un sistema de PKS que comprende al menos un dominio biológicamente activo de un sistema de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) , en el que el al menos un dominio del sistema de PKS de AGPI comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 y fragmentos biológicamente activos de las mismas, en la que los fragmentos biológicamente activos presentan una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ;

b) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 70% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 66, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ; y

c) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 68, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ;

en el que el microorganismo se modifica genéticamente mediante transfección con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para el al menos un dominio de un sistema de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) .

8. Microorganismo modificado genéticamente según la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos expuesta en b) .

9. Microorganismo modificado genéticamente según la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en b) o c) .

10. Microorganismo modificado genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el microorganismo es un traustoquitridio.

11. Microorganismo modificado genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el microorganismo es un Schizochytrium.

12. Planta modificada genéticamente, en la que la planta se ha modificado genéticamente para expresar de manera recombinante un sistema de PKS que comprende al menos un dominio biológicamente activo de un sistema de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) , en la que el dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 y fragmentos biológicamente activos de las mismas, en la que los fragmentos biológicamente activos presentan una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ;

b) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 70% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 66, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) ; y

c) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 68, en la que la secuencia de aminoácidos tiene una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en actividad enoil-ACP reductasa (ER) y actividad β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) .

13. Planta modificada genéticamente según la reivindicación 12, en la que la secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos expuesta en b) .

14. Planta modificada genéticamente según la reivindicación 12, en la que la secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en b) o c) .

15. Microorganismo modificado genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el microorganismo o la planta se ha modificado genéticamente además para expresar de manera recombinante al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos un dominio biológicamente activo de un sistema de PKS seleccionado del grupo que consiste en: un sistema de PKS de AGPI bacteriano, un sistema de PKS de tipo I, un sistema de PKS de tipo II, un sistema de PKS modular, y un sistema de PKS de AGPI no bacteriano.

16. Microorganismo o planta modificado genéticamente según la reivindicación 15, en el que el sistema de PKS de AGPI no bacteriano es un sistema de PKS de AGPI de traustoquitridio.

17. Microorganismo o planta modificado genéticamente según la reivindicación 16, en el que el sistema de PKS de AGPI de traustoquitridio es un sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium.

18. Método para producir una molécula bioactiva que se produce mediante un sistema de policétido sintasa, que comprende hacer crecer o cultivar en condiciones eficaces para producir la molécula bioactiva en el microorganismo modificado genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 o la planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el microorganismo modificado genéticamente o la planta modificada genéticamente produce un perfil de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) que difiere del perfil del microorganismo o la planta que se produce de manera natural sin modificación genética.

20. Método según la reivindicación 18, en el que el microorganismo expresa de manera endógena un sistema de PKS de AGPI no bacteriano, y en el que la modificación genética comprende sustitución de un dominio de un sistema de PKS diferente por una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos un dominio del sistema de PKS de AGPI no bacteriano.

21. Método según la reivindicación 18, en el que la molécula bioactiva se selecciona del grupo que consiste en: una formulación antiinflamatoria, un agente quimioterápico, un excipiente activo, un fármaco para la osteoporosis, un antidepresivo, un anticonvulsivo, un fármaco anti-Helicobacter pylori, un fármaco para el tratamiento de una

enfermedad neurodegenerativa, un fármaco para el tratamiento de una enfermedad hepática degenerativa, un antibiótico, un ácido graso poliinsaturado (AGPI) y una formulación hipocolesterolemiante.

22. Método según la reivindicación 18, en el que la molécula bioactiva es una molécula que incluye dobles enlaces carbono-carbono en la configuración cis o una molécula que incluye un doble enlace cada tres carbonos.

23. Método para producir una planta que tiene un perfil de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) que difiere del de la planta que se produce de manera natural, que comprende modificar genéticamente células de la planta mediante transformación para expresar un sistema de PKS que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos un dominio biológicamente activo de un sistema de PKS de AGPI, en el que el al menos un dominio del sistema de PKS de AGPI comprende una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

24. Método para modificar un producto final que contiene al menos un ácido graso, que comprende añadir al producto final un aceite producido por una célula huésped recombinante que expresa al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos un dominio biológicamente activo de un sistema de PKS de AGPI, en el que el al menos un dominio de un sistema de PKS de AGPI comprende una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

25. Método según la reivindicación 24, en el que el producto final se selecciona del grupo que consiste en un suplemento dietético, un producto alimenticio, una formulación farmacéutica, una leche de animal humanizada y un preparado para lactantes.

26. Método según la reivindicación 25, en el que la formulación farmacéutica se selecciona del grupo que consiste en una formulación antiinflamatoria, un agente quimioterápico, un excipiente activo, un fármaco para la osteoporosis, un antidepresivo, un anticonvulsivo, un fármaco anti-Helicobacter pylori, un fármaco para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, un fármaco para el tratamiento de una enfermedad hepática degenerativa, un antibiótico y una formulación hipocolesterolemiante.

27. Método según la reivindicación 24, en el que el producto final se usa para tratar un estado seleccionado del grupo que consiste en: inflamación crónica, inflamación aguda, trastorno gastrointestinal, cáncer, caquexia, reestenosis cardiaca, trastorno neurodegenerativo, trastorno degenerativo del hígado, trastorno de lípidos sanguíneos, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad autoinmunitaria, preeclampsia, parto prematuro, maculopatía relacionada con la edad, trastorno pulmonar y trastorno peroxisomal.

28. Método para producir una leche de animal humanizada, que comprende modificar genéticamente células productoras de leche de un animal productor de leche con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos un dominio biológicamente activo de un sistema de PKS de AGPI, en el que el al menos un dominio del sistema de PKS de AGPI comprende una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

29. Microorganismo traustoquitridio modificado genéticamente, en el que el microorganismo tiene un sistema de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) endógeno, y en el que el sistema de PKS de AGPI endógeno se ha modificado genéticamente delecionando al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos un dominio del sistema de PKS de AGPI endógeno e insertando una secuencia de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; en el que el perfil de expresión de un ácido graso poliinsaturado (AGPI) por el microorganismo traustoquitridio modificado genéticamente está alterado en comparación con el microorganismo traustoquitridio en ausencia de la modificación genética.

30. Microorganismo traustoquitridio modificado genéticamente según la reivindicación 29, en el que el perfil de producción de AGPI se altera para iniciar, aumentar o disminuir la producción por el microorganismo de un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en: ácido eicosapentanoico (EPA) , ácido docosahexanoico (DHA) , uno o ambos isómeros de ácido docosapentanoico (DPA) y ácido araquidónico (ARA) .

31. Microorganismo traustoquitridio modificado genéticamente según la reivindicación 29, en el que el traustoquitridio es de un género seleccionado del grupo que consiste en Schizochytrium, Thraustochytrium y Japonochytrium.

32. Microorganismo traustoquitridio modificado genéticamente según la reivindicación 29, en el que el traustoquitridio es de una especie de Schizochytrium seleccionada del grupo que consiste en: Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum y Schizochytrium minutum.