SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGA PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE BIBLIOTECAS METAGENÓMICAS.

La presente invención se relaciona con el desarrollo de unas células hospedadoras como sistemas de expresión que ofrecen la posibilidad de identificar genes de interés que no se expresan por ellos mismos en bacterias que albergan una biblioteca metagenómica,

permitiendo así la detección de las funciones que codifican, que de lo contrario permanecerían silenciadas y sin detectar.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201100908.

Solicitante: UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: SANTERO SANTURINO,EDUARDO, TERRÓN GONZÁLEZ,Laura, LIMÓN MORTES,Cristina.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/70 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
  • C12N15/72 C12N 15/00 […] › Sistemas de expresión que utilizan secuencias reguladoras derivadas del operón lac.
SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGA PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE BIBLIOTECAS METAGENÓMICAS.

Fragmento de la descripción:

Sistemas de expresión heteróloga para el análisis funcional de bibliotecas metagenómicas.

Campo de la invención

La presente invención va dirigida al aislamiento de genes que codifican para funciones o actividades de interés. La invención se refiere a las áreas de la genética microbiana y la tecnología de ADN recombinante. Más específicamente, la invención se refiere a la combinación de elementos de diferentes circuitos reguladores de fagos y bacterias para construir vectores y cepas especializadas para su uso en el análisis funcional de bibliotecas metagenómicas.

Antecedentes de la invención

La metagenómica funcional o análisis metagenómico dirigido a la función ofrece la posibilidad de descubrir nuevas proteínas con funciones conocidas, nuevas proteínas con funciones novedosas, proteínas conocidas con funciones únicas y productos naturales novedosos que tienen actividades útiles en la medicina, agricultura o industria. Sin embargo, también es un reto encontrar la célula huésped que incluya todos los genes requeridos para expresar la función de interés y que exprese dicha función. El análisis según la función comienza con un examen amplio para identificar clones que expresan un rasgo deseado, seguido por la caracterización de los clones activos mediante análisis de secuencias y bioquímico. El éxito requiere la expresión fiel del gen o genes de interés y la secreción del producto génico, si el examen o ensayo requiere que sea extracelular.

La limitación significativa es que muchos genes, quizá la mayoría, no se expresarán en cualquier bacteria huésped particular seleccionada para la clonación. De hecho, existe una contradicción inherente en este enfoque ya que los genes se clonan a partir de organismos exóticos desconocidos para descubrir nuevos motivos en biología y sin embargo se requiere que estos genes se expresen en Escherichia coli u otra bacteria domesticada con el fin de que se detecten.

Es esencial desarrollar sistemas de expresión de genes heterólogos en las bacterias que albergan la biblioteca metagenómica con el fin de maximizar las posibilidades de expresar cualquier gen presente en la biblioteca metagenómica. Esto ampliará claramente el potencial de la metagenómica funcional.

La gran mayoría de los microorganismos en entornos naturales no pueden cultivarse. Por tanto, una enorme fuente de información genética sigue sin descubrirse incluso tras un examen extensivo basado en métodos de cultivo convencionales. Para explorar estas fuentes, se han desarrollado enfoques novedosos que implican el aislamiento y la clonación directos de ADN de muestras del entorno en vectores adecuados, creando así bibliotecas metagenómicas complejas.

Las bibliotecas metagenómicas pueden analizarse para determinar rutas y genes novedosos con técnicas basadas en secuencias o mediante análisis, que implican el examen de la actividad, de la expresión de rasgos fenotípicos novedosos en huéspedes sustitutos. La ventaja de tales enfoques de examen funcional es que pueden detectar actividades que se originan a partir de genes cuyas funciones no pueden predecirse mediante análisis bioinformáticos de secuencias de ADN o proteicas. Por otro lado, la identificación de actividades novedosas mediante examen funcional depende de la expresión satisfactoria de los genes clonados. La limitación significativa es que muchos genes, quizá la mayoría, no se expresarán en cualquier bacteria huésped particular seleccionada para la clonación. Incluso aunque se han expresado actividades novedosas usando E. coli como huésped, existe una ventaja potencial obvia de aumentar las posibilidades de expresión génica metagenómica en los huéspedes bacterianos para detectar capacidades de expresión adicionales.

Un enfoque para aumentar las posibilidades de expresión génica metagenómica consiste en clonar fragmentos de ADN metagenómico cortos de unas pocas kilobases de longitud en vectores de expresión que contienen un promotor cerca del sitio de clonación y cuya transcripción puede discurrir por el ADN metagenómico. Por tanto, la expresión génica se basa en la transcripción génica a partir del promotor de vector heterólogo. El principal inconveniente es que el ADN que va a expresarse no debe portar un terminador de la transcripción entre el promotor del vector y el gen de interés. Por tanto, las posibilidades de expresión génica metagenómica se correlacionan inversamente con el tamaño del ADN clonado. La reducción del tamaño de los fragmentos de ADN clonado en las bibliotecas metagenómicas implica que la probabilidad de tener un gen de interés en un clon se reduce también y, por tanto, se requieren un mayor número de clones metagenómicos para cubrir la misma longitud de ADN metagenómico total. Este enfoque ha sido satisfactorio para identificar actividades que pueden seleccionarse y dependen de la expresión de un único gen (Sommer et al., 2009 Science 28, 325(5944): 1128-31) pero no parece ser adecuado para actividades que no pueden seleccionarse ya que requiere la obtención y el examen de un mayor número de clones metagenómicos. La limitación es incluso mayor cuando la actividad de interés requiere la expresión de más de un gen.

Los vectores más comunes usados para construir bibliotecas metagenómicas se basan en el factor sexual F de E. coli, que pueden mantener de manera estable grandes fragmentos de ADN. Estos vectores pueden ser vectores de tipo fósmido, que pueden estar empaquetados en cabezas de fagos lambda, o BAC (cromosomas artificiales bacterianos) que albergan y mantienen fragmentos de ADN incluso mayores. La expresión de genes metagenómicos en esta clase de bibliotecas se basa en su propia capacidad de expresión en el huésped bacteriano.

El vector pCC1FOS es uno de los vectores tipo fósmido más común, usado para construir bibliotecas metagenómicas (casi 300 publicaciones usaron este vector en los últimos 5 años). Puede albergar aproximadamente 40 kb de ADN de inserto, que se empaquetan eficazmente en partículas lambda. Además del replicón F, el vector alberga un replicón adicional que proporciona un mayor número de copias que puede activarse haciendo crecer las bacterias con arabinosa. Esto es muy conveniente para amplificar la función o actividad de interés, lo que facilita su detección si el gen codificante se expresa en E. coli. Se han construido con diferentes grados de éxito varios vectores basados en F para permitir la transferencia y el mantenimiento de la biblioteca metagenómica entre diferentes bacterias huésped en un intento por aumentar las posibilidades de expresar un gen metagenómico en diferentes antecedentes bacterianos (Sosio et al., 2000 Nature Biotechnol 18: 343-345; Martínez et al., 2004 Appl. Environ. Microb. 70: 2452-2463; Hain et al., 2008 Microb. 74: 1892-1901; Aakvik et al, 2009 FEMS Microbiol Lett 296: 149-158). Sin embargo, la expresión de los genes metagenómicos todavía se basa en su propia capacidad de expresión en el huésped bacteriano.

Es esencial, por tanto, desarrollar nuevas herramientas biológicas basadas en la expresión génica heteróloga para aprovechar la metagenómica funcional potencial.

Compendio de la invención

Los inventores han desarrollado unos sistemas de expresión que, sorprendentemente, ofrecen la posibilidad de identificar genes de interés que no se expresan por ellos mismos en las bacterias que albergan la biblioteca metagenómica, permitiendo así la detección de las funciones que codifican, que de lo contrario permanecerían silenciadas y sin detectar. Esto da como resultado un mayor número de clones metagenómicos que presentan una función de interés particular para una biblioteca metagenómica dada.

Una ventaja adicional, proporcionada por el gfp carente de promotor en el vector, es que los sistemas reguladores desconocidos que responden a cualquier señal que puede actuar en las células de la invención pueden identificarse usando la tecnología SIGEX (Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23: 88-93).

Por tanto la presente invención facilita la expresión génica metagenómica permitiendo la identificación de las funciones de los genes por un lado y el uso adicional de un gen indicador que permite detectar sistemas reguladores metagenómicos que pueden actuar en la cepa huésped.

En un primer aspecto la invención se relaciona con el vector 1 para el clonaje de ADN en una célula hospedadora, en donde dicho vector de clonaje es...

 


Reivindicaciones:

1. Una célula hospedadora que comprende un fragmento de ADN insertado en su genoma en donde dicho fragmento comprende

i) una secuencia del gen nahR, ii) un promotor pnah, iii) un promotor psal, y iv) una secuencia del gen N del fago lambda,

en donde el promotor ii) está operativamente unido a la secuencia i), el promotor iii) está operativamente unido a la secuencia iv) y en donde las secuencias i) y iv) se transcriben de manera divergente.

2. Una célula hospedadora que comprende

(a) un fragmento de ADN insertado en su genoma en donde dicho fragmento comprende i) una secuencia del gen nahR, ii) un promotor pnah, iii) un promotor psal, y iv) una secuencia del gen N del fago lambda, \quaden donde el promotor ii) está operativamente unido a la secuencia i), el promotor iii) está operativamente unido a la secuencia iv) y en donde las secuencias i) y iv) se transcriben de manera divergente; y (b) un vector para el clonaje de ADN en una célula hospedadora, en donde dicho vector de clonaje es un vector artificial que se replica autónomamente en el- interior de dicha célula hospedadora, que comprende: -\vtcortaunaun origen de transferencia de ADN, -\vtcortaunaun promotor regulable psal, -\vtcortaunauna secuencia que codifica para el sitio nutL, y -\vtcortaunaun sitio de clonación de ADN metagenómico. \quado \quadun vector para el clonaje de ADN en una célula hospedadora, en donde dicho vector de clonaje es un vector artificial que se replica autónomamente en el interior de dicha célula hospedadora, que comprende: -\vtcortaunaun origen de transferencia de ADN, -\vtcortaunaun promotor regulable psal, -\vtcortaunauna secuencia que codifica para el sitio nutL, -\vtcortaunaun promotor T7, y -\vtcortaunaun sitio de clonación de ADN metagenómico, \quaden donde dicho vector contiene además un ADN metagenómico en el sitio de clonación de ADN metagenómico operativamente unido al promotor psal y en donde dicha célula permite la transcripción del ADN metagenómico desde el promotor psal presente en dicho vector.

3. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha célula es una bacteria.

4. Célula según la reivindicación 3, en donde dicha bacteria es Escherichia coli.

5. Método para la expresión heteróloga de bibliotecas metagenómicas y analizar la función de genes que comprende el uso de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.


 

Patentes similares o relacionadas:

ENZIMA CON ACTIVIDAD ALFA-AMILASA CON EXTREMA TERMOTOLERANCIA Y TERMOESTABILIDAD, PARA LA INDUSTRIA DEL PROCESAMIENTO DEL ALMIDÓN, del 9 de Julio de 2020, de UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA: La presente invención se relaciona con una enzima hidrolasa modificada tipo alfa-amilasa termoestable y termorresistente, que comprende una secuencia […]

PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE D-DIBOA Y SUS DERIVADOS CLORADOS A PARTIR DE SUS PRECURSORES NITROFENOXIDO-ACETATO, del 7 de Julio de 2020, de UNIVERSIDAD DE CADIZ: Producción biotecnológica de D-Diboa y sus derivados clorados a partir de sus precursores nitrofenoxido-acetato. El área científica al que corresponde la invención es la […]

Vacuna subunitaria contra Mycoplasma spp., del 1 de Julio de 2020, de Agricultural Technology Research Institute: Una composición para prevenir una infección por Mycoplasma spp., que comprende: un principio activo, que comprende una proteína de PdhA; y un adyuvante […]

PRODUCCION BIOTECNOLOGIA DE D-D!BOA Y SUS DERIVADOS CLORADOS A PARTIR DE SUS PRECURSORES NITROFENOXIDO-ACETATO, del 25 de Junio de 2020, de UNIVERSIDAD DE CADIZ: La invención tiene como propósito la producción biotecnológica de D-DIBQA, un compuesto análogo al herbicida natural DIBOA, a partir del precursor 2-(2'-nitrofenoxi)- […]

UN PROCESO PARA LA OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE DE ALOFICOCIANINA FUNCIONAL, del 18 de Junio de 2020, de UNIVERSIDAD DE CONCEPCION: La presente tecnología corresponde a un proceso para la obtención de la proteína recombinante de Aloficocianina funcional el cual está basado en […]

Células huéspedes modificadas y usos de las mismas, del 22 de Abril de 2020, de GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A.: Una célula huésped que comprende: i. un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa derivada de un racimo rfb de Pseudomonas; ii. un ácido nucleico […]

Cepas bacterianas que expresan genes de metilasa y sus usos, del 22 de Abril de 2020, de LOMA LINDA UNIVERSITY: Una bacteria aislada para usar en la producción de ADN plasmídico metilado, en donde la bacteria comprende un polinucleótido exógeno que codifica una CpG metilasa […]

Microorganismo capaz de producir l-aminoácido y método para producir L-aminoácido mediante el uso del mismo, del 1 de Abril de 2020, de CJ CHEILJEDANG CORPORATION: Una cepa de E. coli que produce L-treonina o L-triptófano, en donde la cepa es una cepa recombinante que se modifica para atenuar la actividad de […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .