SISTEMA PARA RECUENTO DE BACTERIAS Y DETERMINACIÓN DE SU SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS.

Sistema para recuento de bacterias y determinación de su susceptibilidad a los antibióticos CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a ensayar fluidos biológicos. En particular, la presente invención se refiere a ensayar ópticamente la orina para detectar bacterias y determinar su susceptibilidad a los antibióticos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Fluidos biológicos tales como la orina, fluidos amnióticos, pleurales, peritoneales y cefalorraquídeos se someten a veces a ensayo por la presencia de bacterias. Como etapa complementaria, se puede requerir determinar la susceptibilidad de tales bacterias infecciosas a los antibióticos para idear un plan de tratamiento si se detecta una infección. Métodos analíticos comunes implican cultivo y o microscopía, requieren expertos y llevan tiempo y recursos. Normalmente, médicos y veterinarios tienen que esperar días para recibir resultados del laboratorio que determinen si un ser humano o un individuo animal está infectado con bacterias y recomiende el antibiótico como lo más apropiado para el tratamiento requerido. Un método para determinar la susceptibilidad bacteriana a agentes antibióticos que requiera menos tiempo se explica en "Light scattering methods for antibiotic sensitivity tests", por J. Murray, P. Evans y D. W. L. Hukins, en J. Clin Pathol, (1.980) 33, 995-1.001. Este método se basa en la observación de que el ángulo de luz dispersada de una muestra de fluido que contiene bacterias cambia después de que se añade un agente antibiótico adecuado al fluido examinado. Se cultivan simultáneamente dos muestras del mismo fluido, una de las cuales es un agente antibiótico. El tiempo de cultivo como se describe es significativamente mayor que la vida media de la proliferación bacteriana y es preferiblemente aproximadamente 90 minutos. Se realizan mediciones de dispersión de la luz por un intervalo angular amplio (incluyendo dispersión posterior) para ambas muestras mediante un fotómetro de dispersión de la luz diferencial. Se calculan parámetros representativos, tal como un parámetro de desplazamiento que es proporcional al área de separación entre las representaciones gráficas de perfiles de dispersión angular de las dos muestras dividido por el intervalo angular. Los valores de tales parámetros se equiparan con una escala de calibración para determinar la susceptibilidad de las bacterias a un agente antibiótico específico. Sin embargo los resultados de implantar este método no son satisfactorios ya que se indica que se obtuvo al menos 20% de discrepancia entre ensayos usando el método descrito comparado con un método común de incubación y microscopía. Además de los métodos de cultivo comunes, se ha desarrollado una serie de técnicas adicionales para la determinación de la presencia de bacterias en fluidos, incluyendo, por ejemplo, tiras de ensayo para investigación de infección del tracto urinario (UTI, por sus siglas en inglés), basadas en el ensayo de la presencia de productos en la muestra creada por infección bacteriana tal como nitrito. Sin embargo, el método mencionado falla a la hora de detectar bacterias que no generan productos específicos. El método requiere alta concentración bacteriana en la muestra examinada y por lo tanto tal procedimiento de investigación tiende a una sensibilidad insuficiente y una especificidad relativamente baja. La solicitud de patente internacional WO 06018839 A2 describe un sistema y un método para detectar y contar bacterias en tales fluidos biológicos. El método descrito incluye las etapas de: (1) retirar partículas más grandes en tamaño que las bacterias por filtración de una muestra del fluido; (2) medir la intensidad de la luz dispersada del fluido filtrado en uno o más puntos desplazados del eje del rayo de luz iluminador; (3) asociar un perfil de dispersión con las medidas de dispersión; (4) comparar el perfil de dispersión asociado con perfiles de dispersión de referencia almacenados; (5) la concentración bacteriana se determina por el recuento respectivo relacionado con el perfil de dispersión de referencia que mejor se adapte al perfil de dispersión asociado. Los perfiles básicos almacenados según el método descrito consisten en perfiles de dispersión medida y o calculada promediada de manera estadística relacionados con muestras calibradas de fluidos filtrados y o combinaciones lineales de tales perfiles. También se describe una cubeta especialmente apta para tal medición de dispersión de la luz. Obviamente tal método puede reducir significativamente el tiempo y laboratorio asociado con la detección de infección bacteriana, sin embargo la susceptibilidad de las bacterias detectadas a los antibióticos queda sin resolver. En la patente de EE.UU. 6.861.230 se describe un método para ensayar el crecimiento característico de las bacterias incluyendo ensayar la susceptibilidad bacteriana a un agente antibiótico. Este método combina cultivar una muestra de fluido y mediciones de luminiscencia de la muestra cultivada. En una fase de preparación se cultiva una muestra del fluido que contiene el agente antibiótico durante un rato para generar un nivel de referencia de adenilato cinasa libre. Se determina la susceptibilidad bacteriana comparando los niveles de adenilato cinasa libre medidos repetidamente de manera que: se realiza una primera medición; después se añade el agente antibiótico a la muestra 2 E06821599 27-10-2011   examinada, que después de una demora de preferiblemente quince minutos se hace una segunda medición. El nivel de adenilato cinasa aumenta en casos en que las bacterias son susceptibles al agente antibiótico. El método descrito se indica que es sensible incluso en casos en que la concentración bacteriana en el fluido examinado es considerablemente bajo y o la segunda medición del nivel de adenilato cinasa se retrasa por un intervalo de tiempo que es más corto que el intervalo de tiempo preferido. Sin embargo su implantación requiere química húmeda, cultivo y el uso de equipo relativamente sofisticado. Por lo tanto, es beneficioso un método de investigación rápido y que ahorre laboratorio que pueda obviar una cantidad significativa de trabajo costoso y que exija tiempo en la realización de los ensayos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es una presentación esquemática de una medición de dispersión de la luz según la presente invención; La Fig. 2 es un diagrama de bloques que describe un sistema para detectar y contar bacterias y determinar su susceptibilidad a los antibióticos según el método de la presente invención; La Fig. 3A es una vista en sección longitudinal de una cubeta para detectar bacterias según una realización preferida del método de la presente invención; La Fig. 3B es una vista en sección longitudinal de una cubeta para detectar bacterias según otra realización preferida del método de la presente invención; La Fig. 4 es un diagrama de flujo que describe un procedimiento para detectar y contar bacterias y determinar su susceptibilidad a los antibióticos según una realización preferida de la presente invención; La Fig. 5 es una imagen de puntos simulada de una muestra de orina sintética que contiene bacterias; La Fig. 6 muestra perfiles de intensidad-tiempo ejemplares calculados para bacterias en un movimiento; La Fig. 7 es un gráfico que presenta distribuciones de frecuencia ejemplares de la intensidad dependiente del tiempo de luz dispersada calculada para un píxel de una imagen de puntos; Las Figs 8A y 8B muestran respectivamente un perfil de intensidad ángulo de dispersión tiempo de una muestra de orina que contiene E-coli y una muestra de orina que contiene partículas de PMMA; La Fig. 8C muestra perfiles de intensidad tiempo medidos a uno de los píxeles mostrados en las Figs 8A; La Fig. 9A muestra gráficos ejemplares de perfiles de dispersión estándar, un perfil de dispersión asociado a intensidades medidas de luz dispersada por una muestra de orina y un perfil de dispersión adaptado, como una función del ángulo de dispersión; Las Figs 9B y 9C muestran respectivamente representaciones gráficas diferentes calculadas en dos puntos diferentes en el tiempo empleando medidas de luz dispersada de una muestra ejemplar que contiene E-coli; La Fig. 9D muestra un perfil de tiempo de un derivado promedio ejemplar de la concentración de dispersores en el tiempo, calculado para una muestra ejemplar que contiene E-coli; Las Figs 10A y 10B muestran respectivamente perfiles de intensidad con velocidad unidireccional constante y por partículas con la misma velocidad unidireccional que se mueven simultáneamente en un movimiento Browniano. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para detectar y contar bacterias suspendidas en un fluido. El procedimiento según... [Seguir leyendo]

1. Un método para recuento de bacterias suspendidas en un fluido, en que una porción de dicho fluido se filtra para excluir partículas mayores que dichas bacterias y una muestra de la porción filtrada se pone en una cubeta que tiene al menos una ventana iluminada con un haz de luz coherente y colimado, comprendiendo el método las etapas de: i. medir repetidamente a una velocidad de repetición predefinida la intensidad de luz dispersada por la muestra a al menos dos ángulos diferentes de dispersión, ii. calcular representaciones gráficas de diferencia de las mediciones de intensidad de la luz a cada uno de los diferentes ángulos de dispersión a los que se mide la intensidad de la luz, comprendiendo cada representación gráfica de diferencia los valores absolutos de diferencias entre niveles de intensidad de luz medidos en dos momentos de tiempo o diferentes al mismo ángulo de dispersión y iii. igualar cada una de dichas representaciones gráficas de diferencia con una curva de calibración para proporcionar una estimación de la concentración de las bacterias en la muestra. 2. Un método según la reivindicación 1, en el que las mediciones se realizan a una pluralidad de ángulos de dispersión para establecer un perfil de dispersión para la muestra. 3. Un método según la reivindicación 1, que comprende además calcular una derivada promedio con respecto al tiempo de la concentración estimada de bacterias. 4. Un método según la reivindicación 1, que comprende además introducir un agente antibiótico en dicha muestra de fluido filtrado previamente al comienzo de la medición de la intensidad de la luz. 5. Un método según la reivindicación 4, que comprende además la etapa de esperar durante al menos un minuto después de introducir el agente antibiótico previamente al comienzo de la medición de la intensidad de la luz. 6. Un método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de introducir un quimioefector en dicha muestra de fluido filtrado previamente a dicha medición. 7. Un método según la reivindicación 1, que comprende además inducir un gradiente de temperatura por dicha muestra de fluido filtrado previamente al comienzo de la medición de la intensidad de la luz. 8. Un método según la reivindicación 1, en el que al menos dicha ventana se caracteriza por una característica óptica seleccionada de un grupo de características ópticas que consiste en transparencia dentro de un intervalo de longitudes de onda que contiene una longitud de onda de dicha luz de iluminación, homogeneidad del índice de refracción que es mejor que 0,0001, el valor de la raíz cuadrada media de la rugosidad superficial de una cara de al menos dicha ventana no excede de 1 nanómetro, la calidad de una cara de al menos dicha ventana definida por una serie de rayas/marcas no excede 40/20 y cualquier combinación de las mismas. 9. Un método según la reivindicación 1, en el que la anchura de al menos dicha ventana no excede de 0,5 milímetros. E06821599 27-10-2011   11 E06821599 27-10-2011   12 E06821599 27-10-2011   13 E06821599 27-10-2011   14 E06821599 27-10-2011   E06821599 27-10-2011   16 E06821599 27-10-2011   17 E06821599 27-10-2011