Sistema para la expresión de componentes de traducción ortogonales en células huésped eubacterianas.
Una composición que comprende un constructo de ácido nucleico,
comprendiendo dicho constructo:secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli yuna primera secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARNt ortogonal (O-ARNt) de Archaea, endonde dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en donde dichas secuencias del promotor y delterminador están unidas operativamente a dicha primera secuencia de nucleótidos expresable y en dondedicha primera secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga de dichas secuencias de nucleótidos delpromotor y del terminador, y en donde dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene la secuencia denucleótidos SEC ID Nº: 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia denucleótidos de SEC ID Nº 33, 35 y 36.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/005914.
Solicitante: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 10550 NORTH TORREY PINES ROAD LA JOLLA, CA 92037 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: SCHULTZ,PETER G, RYU,YOUNGHA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- G06Q10/00 FISICA. › G06 CALCULO; CONTEO. › G06Q METODOS O SISTEMAS DE PROCESAMIENTO DE DATOS ESPECIALMENTE ADAPTADOS PARA FINES ADMINISTRATIVOS, COMERCIALES, FINANCIEROS, DE GESTION, DE SUPERVISION O DE PRONOSTICO; METODOS O SISTEMAS ESPECIALMENTE ADAPTADOS PARA FINES ADMINISTRATIVOS, COMERCIALES, FINANCIEROS, DE GESTION, DE SUPERVISION O DE PRONOSTICO, NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR. › Administración; Gestión.
PDF original: ES-2432391_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Sistema para la expresión de componentes de traducción ortogonales en células huésped eubacterianas
Campo de la invención La invención se refiere al campo de la química de las proteínas, por ejemplo la bioquímica de la traducción. La invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción in vivo de polipéptidos que comprende uno o más aminoácidos no naturales.
Antecedentes de la invención El estudio de la estructura y función de las proteínas ha dependido históricamente de las propiedades químicas que están disponibles usando los grupos R de los aminoácidos naturales. Por desgracia, todos los organismos conocidos, desde bacterias a seres humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes (con las raras excepciones de la selenocisteína (véase, por ejemplo, Bock y col., (1991) , Molecular Microbiology 5:515-20) y la pirrolisina. Esta limitada selección de grupos R ha restringido el estudio de la estructura y función de las proteínas, en el que los estudios están limitados por las propiedades químicas de los aminoácidos naturales.
Se ha desarrollado una metodología general para la incorporación específica de sitio in vivo de aminoácidos no naturales químicamente diversos con nuevas propiedades fisicoquímicas y biológicas en proteínas de organismos procariotas y eucariotas (Wang y col., Science 292, 498-500 (2001) ; Chin, y col., Science 301, 964-967 (2003) ; Wang y Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 44, 34-66 (2005) ) . Este procedimiento depende de un único par de codón-ARNt y la correspondiente aminoacil-ARNt sintetasa (aaRS o simplemente RS) para cada aminoácido no natural que funciona con eficiencia en la traducción de proteínas pero que no reacciona de forma cruzada con cualquiera de los ARNt endógenos, RS, aminoácidos o codones en el organismo del huésped (es decir, debe ser ortogonal) . El uso de dichos pares ARNt-RS ortogonales ha posibilitado codificar genéticamente un gran número de aminoácidos de estructura diversa que incluyen aquéllos con reactividad química (Wang et al., Proc. Natl. Sci. Acad. USA. 100, 5661 (2003) ) y fotoquímica (Chin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11020-11024 (2002) ; Wu et al., J. Am. Chem.
Soc., 126, 14306-14307 (2004) ) , así como glicosilada (Zhang et al., Science 303, 371-373 (2004) ) fluorescente (Wang y Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 44:34-66 (2005) ) , unión a metales (Wang y Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 44:34-66 (2005) ) y aminoácidos activos en redox (Alfonta et al., J. Am. Chem. Soc. 125:14662-14663 (2003) ) . Un par MjtRNA-Tyr (CUA) -MjTyrRS mutante concreto ha sido particularmente útil para codificar nuevos aminoácidos en E. coli (Wang y Schultz, Chem. Biol. 8:883-890 (2001) ) .
El documento WO 2005/007870 describe composiciones de pares de leucil-ARNt y aminoacil-ARNt sintetasa y usos de las mismas.
El documento WO 2004/094593 describe composiciones de pares de ortogonal-ARNt y aminoacil ARNt sintetasa 40 ortogonal y usos de los mismos para incorporar aminoácidos no naturales en una proteína de interés.
El documento US 2005/272121 describe la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales que contienen átomos pesados en proteínas para determinar la estructura.
Wang y Schultz, 2001, Chemistr y & Biology, vol. 8, pp. 883-890, describen un abordaje general para la generación de ARNt ortogonales.
No obstante, a pesar del éxito de esta técnica en la incorporación de una matriz diversa de aminoácidos no naturales in vivo, la eficiencia del sistema de expresión para la producción de proteínas mutantes que contienen aminoácidos 50 no naturales no se ha optimizado y la eficacia de la supresión del sistema ortogonal para superar el codón selector puede ser mala. En la técnica existe la necesidad de desarrollar reactivos para mejorar la eficiencia en la supresión de los sistemas de traducción. La invención descrita en el presente documento cumple estas y otras necesidades y será evidente a partir de la revisión de la divulgación siguiente.
Sumario de la invención La presente invención proporciona una composición que comprende un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo: Secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli y una primera secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARNt ortogonal (O60 ARNt) de Archaea, en el que dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en el que dichas secuencias del promotor y del terminador están unidas operativamente a dicha primera secuencia de nucleótidos expresable y en el que dicha primera secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga de dichas secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador, y en el que dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos 65 de SEC ID Nº 33, 35 y 36.
En ciertos casos de la composición de la presente invención, el constructo de ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos del promotor de E. coli glns que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 13 y una segunda secuencia de nucleótidos expresable, en el que dicha secuencia de nucleótidos del promotor de E. coli glns está unida operativamente a dicha segunda secuencia de nucleótidos expresable, de modo que la segunda secuencia de nucleótidos expresable codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que dicha O-RS aminoacila, preferentemente, dicha O-ARNt con un aminoácido no natural.
En ciertos casos de la composición de la presente invención, dicho O-ARNt está codificado por una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) ; o en el que dicha secuencia de nucleótidos expresable es un operón policistrónico que comprende una pluralidad de O-ARNt cada uno de los cuales tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) .
En algunos casos, dicha secuencia de nucleótidos expresable comprende una pluralidad de dicho operón policistrónico.
En algunos casos, dicha O-RS es una aminoacil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o (ii) dicha O-RS es una tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o (iii) dicha O-RS tiene una sustitución de ácido aspártico en arginina en la posición de aminoácidos 286 o en una posición análoga a la posición 286 respecto a la secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii proporcionada en la SEC ID Nº 2 (MjtRNA-Tyr RS de tipo silvestre) .
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende la composición de la presente invención.
En algunos casos, dicha célula huésped es una célula huésped eubacteriana o dicha célula huésped es una célula de E. coli.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un sistema de traducción para la expresión de un polipéptido de interés que comprende al menos un aminoácido no natural en una posición especificada; comprendiendo el sistema:
(a) un aminoácido no natural;
(b) un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo:
(i) las secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli y una secuencia de nucleótidos expresable , en la que dicha secuencia de nucleótidos expresable codifica un ARNt ortogonal (O-ARNt) de Archaea, en el que dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en el que dichas secuencias del promotor y del terminador están unidas operativamente a dicha secuencia de nucleótidos expresable y en la que dicha secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga de dichas secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador, y en la que dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 33, 35 y 36; y
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que dicha O-RS aminoacila preferentemente dicho O-ARNt con dicho aminoácido no natural; y 45
(c) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de interés, comprendiendo dicho polinucleótido al menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt, en el que la posición del codón selector en el polinucleótido controla la posición especificada del aminoácido no natural en el polipéptido de interés tras la expresión del polinucleótido para producir el polipéptido.
En algunos casos, dicho constructo de ácido nucleico comprende además al menos uno de:
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Reivindicaciones:
1. Una composición que comprende un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo:
secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli y una primera secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARNt ortogonal (O-ARNt) de Archaea, en donde dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en donde dichas secuencias del promotor y del terminador están unidas operativamente a dicha primera secuencia de nucleótidos expresable y en donde dicha primera secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga de dichas secuencias de nucleótidos del
promotor y del terminador, y en donde dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 33, 35 y 36.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que: 15
(i) el constructo de ácido nucleico comprende además un promotor de glnS de E. coli modificado que tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 13 y una segunda secuencia de nucleótidos expresable, en donde dicha secuencia de nucleótidos del promotor glns de E. coli está unida operativamente a dicha segunda secuencia de nucleótidos expresable, de modo que la segunda secuencia de nucleótidos expresable codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en donde dicha O-RS aminoacila, preferentemente, dicha O-ARNt con un aminoácido no natural.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho O-ARNt está codificado por una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) ; o en la que dicha secuencia de nucleótidos expresable es un operón policistrónico que comprende una pluralidad de O-ARNt cada uno de los cuales tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) .
4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha primera secuencia de nucleótidos expresable comprende una pluralidad de dicho operón policistrónico. 30
5. La composición de la reivindicación 2, en la que:
(i) dicha O-RS es una aminoacil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o (ii) dicha O-RS es una tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o (iii) dicha O-RS tiene una sustitución de ácido aspártico en arginina en la posición de aminoácidos 286 o en una posición análoga a la posición 286 respecto a la secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre proporcionada en la SEC ID Nº: 2 (Mj-tRNA-Tyr RS de tipo silvestre) .
6. Una célula huésped que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 40
7. La célula huésped de la reivindicación 6, en la que dicha célula huésped es una célula huésped eubacteriana o dicha célula huésped es una célula de E. coli.
8. Un sistema de traducción para la expresión de un polipéptido de interés que comprende al menos un aminoácido 45 no natural en una posición especificada; comprendiendo el sistema:
(a) un aminoácido no natural;
(b) un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo:
(i) secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli y una secuencia de nucleótidos expresable, en la que dicha secuencia de nucleótidos expresable codifica un ARNt ortogonal (O-ARNt) de Archaea, en donde dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en donde dichas secuencias del promotor y del terminador están unidas operativamente a dicha secuencia de nucleótidos expresable y en donde dicha secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga 55 de dichas secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID Nº 33, 35 y 36; y
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que dicha O-RS aminoacila preferentemente dicho O-ARNt con dicho aminoácido no natural; y 60
(c) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de interés, comprendiendo dicho polinucleótido al menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt, en el que la posición del codón selector en el polinucleótido controla la posición especificada del aminoácido no natural en el polipéptido de interés tras la expresión del polinucleótido para producir el polipéptido.
9. El sistema de traducción de la reivindicación 8, en el que dicho constructo de ácido nucleico comprende además al menos uno de:
(i) una secuencia de nucleótidos que tiene un promotor de glnS de E. coli que tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 13, en la que dicha secuencia de nucleótidos de glnS de E. coli está unida operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha O-RS; y
(ii) un operón policistrónico que comprende una pluralidad de dichas secuencias de nucleótidos del gen de O-ARNt, en el que al menos un gen de O-ARNt está separado de al menos un gen de O-ARNt adyacente por un adaptador polinucleotídico heterólogo de un adaptador polinucleotídico de un operón de ARNt.
10. El sistema de traducción de la reivindicación 9, en el que dichas secuencias del promotor y del terminador del ARNt de prolina de E. coli se proporcionan en las SEC ID Nº 32 (promotor) y 33 (terminador) , respectivamente; o en el que dicho operón policistrónico comprende una pluralidad de adaptadores polinucleotídicos heterólogos idénticos.
o en el que dicho operón policistrónico comprende una pluralidad de adaptadores polinucleotídicos heterólogos, en 15 el que al menos dos de los adaptadores polinucleotídicos heterólogos son diferentes;
(adaptador valU/valX) o 15 (adaptador ileT/alaT) . 25
11. El sistema de traducción de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica un O-ARNt es un operón policistrónico que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican un O-ARNt.
una posición análoga a la posición 286 respecto a la secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre que se proporciona en la SEC ID Nº: 2 (Mj-tRNATyr RS de tipo silvestre) .
12. El sistema de traducción de la reivindicación 8, que comprende una célula huésped que comprende (a) , (b) y (c) .
13. El sistema de traducción de la reivindicación 12, en el que dicha célula huésped es una célula huésped eubacteriana.
14. Un procedimiento para producir en una célula huésped un polipéptido de interés, que comprende un aminoácido
no natural en una posición especificada; comprendiendo el procedimiento: 45
(a) proporcionar:
(i) un aminoácido no natural;
(ii) un constructo de ácido nucleico que comprende:
secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli y una secuencia de nucleótidos expresable, en donde dicha secuencia de nucleótidos expresable codifica un ARNt ortogonal de Archaea (O-ARNt) . en donde dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en el que dichas secuencias del
promotor y del terminador está unidos operativamente a dicha secuencia de nucleótidos expresable y en donde dicha secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga de dichas secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador, en donde dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 33, 35 y 36; y una secuencia de nucleótidos que codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que dicha O-RS aminoacila preferentemente dicho O-ARNt con dicho aminoácido no natural; y
(iii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de interés, comprendiendo dicho polinucleótido al
menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt y en el que la posición del codón selector se 65 correlaciona con la posición especificada del aminoácido no natural en el polipéptido de interés.
(iv) una célula huésped que comprende (i) , (ii) y (iii) ; y
(b) cultivar dicha célula huésped; y
(c) incorporar dicho aminoácido no natural en dicha posición especificada en dicho polipéptido durante la
traducción de dicho polipéptido en dicha célula huésped, de modo que se produce dicho polipéptido de interés 5 que comprende dicho aminoácido no natural en la posición especificada.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar un operón policistrónico que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican una o más especies de O-ARNt; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifican un O-ARNt que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) ; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar un operón policistrónico que comprende una pluralidad de la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) ; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una aminoacil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica una O-RS que tiene una sustitución de ácido aspártico en arginina en la posición de aminoácidos 286 o en una posición análoga a la posición 286 respecto a la secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre proporcionada en la SEC ID Nº 2 (Mj-tRNATyrRS de tipo silvestre) ; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar al menos uno de:
(I) secuencias del promotor y del terminador que comprenden las secuencias del promotor y del terminador de proK de E. coli proporcionadas en las SEC ID Nº 32 (promotor) y 33 (terminador) , respectivamente;
(II) una secuencia de nucleótidos del promotor que tiene un promotor de glnS modificado de E. coli que tiene
una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 13, en donde dicha secuencia de nucleótidos de glnS de E. coli está unida operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha O-RS; y
(III) un operón policistrónico que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos del gen de O-ARNt, en el que al menos un gen de O-ARNt está separado de al menos un gen de O-ARNt adyacente por un adaptador polinucleotídico heterólogo de un adaptador polinucleotídico de un operón de ARNt.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha provisión de un operón policistrónico de (III) comprende proporcionar una pluralidad de adaptadores polinucleotídicos heterólogos idénticos; o en el que dicha provisión de un operón policistrónico de (III) comprende proporcionar una pluralidad de adaptadores polinucleotídicos heterólogos, en el que al menos dos de los adaptadores polinucleotídicos heterólogos son diferentes; o en el que dicha provisión de un operón policistrónico de (III) comprende proporcionar un adaptador polinucleotídico heterólogo que comprende un nucleótido timidina en el extremo 5', un nucleótido adenosina en el extremo 3’ o ambos un nucleótido timidina en el extremo 5' y un nucleótido adenosina en el extremo 3’; o en el que dicha provisión de un operón policistrónico de (III) comprende proporcionar un adaptador polinucleotídico heterólogo del adaptador polinucleotídico localizado entre los genes de ARNt endógenos de Escherichia coli seleccionados de: valU y valX; ileT y alaT; serV y argV; valV y valW; glyT y thrT; metT y leuW; glnW y metU; hisR y leuT; glnU y glnW; leuP y leuV; glnV y glnX; alaW y alaX; ileU y alaU; ile V y alaV; metU y glnV; glyW y cysT; argX y hisR; y argY y argZ; o en el que dicha provisión de un operón policistrónico de (III) comprende proporcionar un adaptador polinucleotídico heterólogo que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 14 (adaptador valU/valX) o 15 (adaptador ileT/alaT) .
17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha provisión de una célula huésped comprende proporcionar una célula huésped eubacteriana o una célula huésped de Escherichia coli.
18. Un procedimiento para producir en una célula huésped un polipéptido de interés, que comprende un aminoácido no natural en una posición especificada; comprendiendo el procedimiento:
(a) proporcionar:
(i) un aminoácido no natural;
(ii) un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARNt 55 ortogonal (O-ARNt) de Archaea, en el que el O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72.
(iii) un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que dicha O-RS aminoacila preferentemente dicho O-ARNt con dicho aminoácido no natural;
(iv) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de interés, comprendiendo dicho polinucleótido al menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt y en el que la posición del codón selector se correlaciona con la posición especificada del aminoácido no natural en el polipéptido de interés; y
(v) una célula huésped que comprende (i) , (ii) , (iii) y (iv) ; en el que dicho constructo de ácido nucleico de (ii) comprende secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli, en donde dichas secuencias de
nucleótidos del promotor y del terminador están unidas operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho O-ARNt, y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho O-ARNt es heteróloga de dichas secuencias del promotor y del terminador, en donde dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 32 o 34 y dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 33, 35 y 36;
(b) cultivar dicha célula huésped; y
(c) incorporar dicho aminoácido no natural en dicha posición especificada en dicho polipéptido durante la traducción de dicho polipéptido en dicha célula huésped, de modo que se produce dicho polipéptido de interés que comprende dicho aminoácido no natural en la posición especificada.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende 10 proporcionar un operón policistrónico que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican una o más especies de O-ARNt: o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifican un O-ARNt que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) ; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar un operón policistrónico que comprende una pluralidad de la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 (MjtRNA
Tyr (CUA) ) ; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una aminoacil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii;
o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico comprende proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica una O-RS que tiene una sustitución de ácido aspártico en arginina en la posición del 20 aminoácido 286 o en una posición análoga a la posición 286 respecto a la secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre que se proporciona en la SEC ID Nº 2 (Mj-tRNATyrRS de tipo silvestre) ; o en el que dicha provisión de un constructo de ácido nucleico de (I) comprende secuencias del promotor y del terminador que comprenden las secuencias del promotor y del terminador de proK de E. coli proporcionadas en las SEC ID Nº 32 (promotor) y 33 (terminador) , respectivamente; o en el que dicha provisión de una célula huésped comprende proporcionar una célula huésped eubacteriana; o en el que dicha provisión de una célula huésped comprende proporcionar una célula huésped de Escherichia coli.
20. Un procedimiento para producir un sistema de traducción para la expresión de un polipéptido de interés que comprende al menos un aminoácido no natural en una posición especificada; comprendiendo el procedimiento 30 proporcionar:
(a) un aminoácido no natural;
(b) un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo:
(i) secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador de un gen de ARNt de prolina de Escherichia coli y una secuencia de nucleótidos expresable, codificando dicha secuencia de nucleótidos expresable un ARNt ortogonal (O-ARNt) de Archaea, en donde dicho O-ARNt de Archaea comprende un par C1-G72 y en donde dichas secuencias del promotor y del terminador están unidas operativamente a dicha secuencia de nucleótidos expresable y en donde dicha secuencia de nucleótidos expresable es heteróloga de dichas secuencias de nucleótidos del promotor y del terminador, y en donde dicha secuencia de nucleótidos del promotor tiene una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 32 o 34; y en donde dicha secuencia de nucleótidos del terminador tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID Nº 33, 35 y 36; y
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en donde dicha O-RS aminoacila preferentemente dicho O-ARNt con dicho aminoácido no natural; y 45
(c) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de interés, comprendiendo dicho polinucleótido al menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt, en el que la posición del codón selector en el polinucleótido controla la posición especificada del aminoácido no natural en el polipéptido de interés tras la expresión del polinucleótido para producir el polipéptido.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que (a) , (b) y (c) se proporcionan en una célula huésped.
TIPO
(derivada de tirosil ARNt-sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre Adaptador del cebador P1 Adaptador del cebador P2 Adaptador del cebador P3 Adaptador del cebador P4
Adaptador del cebador P5
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Seguimiento de contenedores, del 26 de Febrero de 2020, de INMARSAT GLOBAL LIMITED: Un sistema de seguimiento de contenedores que comprende una pluralidad de contenedores con paredes metálicas , al menos uno de los contenedores […]
Mejoras en sistema electrónico antirrobo para el control, identificación y detección del fruto del olivar, del 20 de Enero de 2020, de OLIDETEC TECHNOLOGY, S.L: Mejoras en sistema electrónico antirrobo para el control, identificación y detección del fruto del olivar. Constituida a partir de un sistema electrónico encapsulado […]
Sistema para proporcionar información del cuerpo de un caballo, método de extracción de datos de imágenes fijas del cuerpo del caballo, programa de extracción de datos de imágenes fijas del cuerpo del caballo, y soporte de grabación legible por ordenador, del 8 de Enero de 2020, de RAKUTEN, INC: Un sistema proveedor de información sobre cuerpos de caballos que comprende: un dispositivo de almacenamiento de datos de imágenes en movimiento […]