SISTEMA PARA EMPAQUETAMIENTO DE ADENOVIRUS DE ALTA CAPACIDAD.
La invención se relaciona con un nuevo sistema de producción y empaquetamiento (encapsidación) para vectores adenovirales de alta capacidad que no requiere de la utilización de virus helper y que se caracteriza porque integra los genes adenovirales necesarios para el control,
replicación y empaquetamiento de las partículas virales dentro del genoma de una célula hospedadora, lo cual mejora la estabilidad del sistema de producción a largo plazo
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200801682.
Solicitante: PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA, S.L..
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: NAVARRA.
Inventor/es: PRIETO VALTUEA,JESUS, QIAN,CHENG, MOURIO LOPEZ,SUSANA.
Fecha de Solicitud: 4 de Junio de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 13 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K48/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- C12N15/861 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores adenovirales.
Clasificación PCT:
- A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- C12N15/861 C12N 15/00 […] › Vectores adenovirales.
Fragmento de la descripción:
Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad.
Campo técnico de la invención
La invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y, más concretamente, en el campo de vectores para la expresión de genes heterólogos en células diana. En particular, la invención se refiere a un sistema para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad útiles para transferencia génica.
Antecedentes
Los adenovirus de alta capacidad (HC), conocidos también como adenovirus gutless o adenovirus helper- dependientes, tienen un gran atractivo como vectores para terapia génica porque in vivo presentan una inmunogenicidad asociada muy reducida y poseen una alta eficiencia de transducción y amplio tropismo, tanto en roedores como en primates. Estos vectores se caracterizan por contener solamente las secuencias de ADN necesarias para su replicación y empaquetamiento y carecer del resto de genes adenovirales, lo que hace que puedan acomodar secuencias de hasta 36 kb. Para la replicación del ADN viral y su empaquetamiento en partículas virales, las únicas secuencias adenovirales requeridas en cis por estos vectores son las secuencias ITR (inverted terminal repeats), localizadas en ambos extremos del ADN lineal, y la señal de empaquetamiento (?) (Gräble y Hearing, 1992, J. Virol., 66: 723-731; Hearing y Shenk, 1983, Cell, 33: 695-703).
Dado que los adenovirus de alta capacidad carecen de todas las regiones virales codificantes, su propagación sólo es posible si las células se co-infectan con un segundo virus denominado virus helper o auxiliar, es decir, un virus capaz de codificar todas las proteínas necesarias para la replicación de un virus defectivo y su encapsidación en partículas virales con capacidad infectiva. En el caso de la producción de vectores adenovirales de alta capacidad, el virus helper se caracteriza por tener delecionada la región E1 adenoviral y proporcionar, in trans, todo el repertorio de proteínas virales necesarias para la replicación y ensamblaje de la progenie del virus gutless. Para la propagación de este último también es necesaria la utilización de líneas celulares capaces de complementar la deleción de dicha región E1 en el virus helper, como son la línea 293 (Graham, et al., 1977, J. Gen. Virol., 36: 59-74) o la línea PerC6 (Fallaux et al., 1998, Hum. Gene Ther., 9: 1909-1917).
Sin embargo con este sistema de propagación se generan también partículas virales indeseables que encapsidan genomas de virus helper y contaminan las preparaciones finales de los adenovirus de alta capacidad. Hasta la fecha se han desarrollado y descrito diferentes sistemas para tratar de eliminar dichas contaminaciones bloqueando el proceso de empaquetamiento del virus helper. En general, estos sistemas están basados en la incorporación de mutaciones en la señal de empaquetamiento del virus helper, en el aumento del tamaño de su genoma y, más particularmente, en una eliminación específica de la señal de empaquetamiento durante el proceso de producción viral.
Parks et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 13565-13570) han descrito la eliminación de la señal de empaquetamiento ? del virus helper mediante un sistema de recombinación Cre-loxP. En este sistema la señal ? está flanqueada por sitios loxP y la propagación del virus se lleva a cabo en células 293 que expresan la recombinasa Cre (células 293Cre). Cuando el virus helper entra en la célula, la recombinasa escinde la señal ? impidiendo que pueda ser empaquetado pero manteniendo su capacidad de replicación y, por tanto, la expresión de las secuencias codificantes necesarias para el empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad.
Groth et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 5995-6000) han propuesto la utilización de una recombinasa unidireccional, en particular la recombinasa F C31, utilizando las secuencias attB/attP de reconocimiento específico para flanquear la señal ?. Cuando la recombinasa PhiC31 escinde la secuencia flanqueada por los sitios attB/attP, modifica las secuencias de reconocimiento y las convierte en secuencias attR/attL evitando que vuelva a producirse el reconocimiento y, por tanto, la reintroducción de la señal ?.
Ng et al. (2001, Mol. Ther., 3: 809-815) proponen un sistema de recombinación alternativo FLP/frt, en el que la propagación del adenovirus de alta capacidad se lleva a cabo en células 293 capaces de expresar la recombinasa FLP de levaduras (línea 293FLP y 293CreFLP) y en el que la señal ? del virus helper está flanqueada por sitios frt reconocidos específicamente por dicha recombinasa FLP. La eficiencia de amplificación del virus gutless (108 bfu/ml en el pase 3), así como los niveles de contaminación de virus helper (0.5% previa purificación en gradiente CsCl), son muy similares a los obtenidos con el sistema Cre-loxP anterior.
Para tratar de mejorar estos sistemas, Palmer y Ng (2003, Mol. Ther., 8: 846-852) han desarrollado un sistema derivado del sistema Cre-loxP, donde se ha incluido la inversión de la señal de empaquetamiento del virus helper.
Por otra parte, Sargent et al. (2004, Gene Ther., 11: 504-511) han propuesto un sistema de restricción por tamaño, en el que se utiliza un virus helper de más de 35 kb y delecionado en el gen de la proteína IX, así como una línea celular 293 capaz de complementar dicha deleción.
Sin embargo, a pesar de las mejoras, hasta el momento ninguno de estos sistemas ha conseguido evitar las recombinaciones entre las secuencias de los dos virus incluidos en el proceso de producción y, por consiguiente, la contaminación de la muestra con adenovirus replicativos. En una reciente revisión Alba et al. (2005, Gene Ther., 12 Suppl 1: S18-27) recogen que los niveles de contaminación pueden oscilar, dependiendo del sistema utilizado, entre un 0.02% y un 1% respecto al número de partículas virales de adenovirus de alta capacidad producidas. Estos niveles de contaminación se consideran demasiado altos para su posible utilización en procedimiento clínicos de terapia génica.
Adicionalmente, otra limitación importante para el uso clínico de los adenovirus de alta capacidad está relacionada con la dificultad para producirlos a gran escala. Actualmente este tipo de producción es compleja, presenta una eficiencia baja y requiere de numerosos ciclos sucesivos de co-infección con el virus helper.
Por todo ello es necesario perfeccionar los procedimientos, desarrollando también sistemas alternativos, para producir vectores adenovirales de alta capacidad en las cantidades y con la calidad (libres de partículas virales contaminantes) requeridas para su uso clínico.
La solución ideal a este problema seria el desarrollo de una línea celular específica para la producción a gran escala de vectores adenovirales de alta capacidad. Sin embargo, los sistemas de producción independientes de la participación de un virus helper, plantean el problema de la citotoxicidad derivada de altos niveles de expresión de los genes adenovirales lo cual, hasta el momento, ha limitado enormemente el desarrollo de este tipo de sistemas de producción. A esto hay que sumarle el hecho de que resulta extremadamente complicado reproducir la secuencia correcta de los eventos necesarios para coordinar la replicación del ADN con la expresión de las proteínas estructurales que permitan la producción masiva de partículas virales durante la fase tardía de la infección (Farley, et al., 2004, J. Virol., 78: 1782-1791).
WO0072887 describe un sistema de producción de adenovirus de alta capacidad independiente de adenovirus helper basado en un sistema binario formado por (i) una línea celular empaquetadora que comprende de forma estable un episoma circular en un número reducido de copias y basado en elementos replicativos del virus de Epstein-Barr (EBV) junto con un genoma adenoviral delecionado en las regiones E1, E3, E4 y en los genes pTP y DBP, y (ii) un vector que comprende los elementos necesarios para la replicación y empaquetamiento del genoma adenoviral y que están ausentes en el episoma (región E4, gen pTP y DBP) así como el gen heterólogo. En este sistema el episoma no se empaqueta en viriones puesto que (i) carece de la señal de empaquetamiento y (ii) su tamaño supera la capacidad de empaquetamiento de los adenovirus.
Reivindicaciones:
1. Un polinucleótido o un vector de expresión que comprende:
2. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicación 1 donde el regulador transcripcional codificado por el casete (a) es un regulador transcripcional activable.
3. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 2 donde el regulador transcripcional activable (a) está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el dominio de activación de NF-kappaB p65.
4. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la endonucleasa de restricción codificada por el casete (b) es I-SceI.
5. Un polinucleótido o vector de expresión que comprende:
6. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 5 dónde el segundo y tercer casete se transcriben en sentido contrario.
7. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 6 dónde la secuencia reguladora de la transcripción que controla el segundo y tercer casete comparten el mismo sitio de unión para el regulador transcripcional (a).
8. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 donde el regulador transcripcional codificado por el casete (a) es un regulador transcripcional activable.
9. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 8 donde el regulador transcripcional activable (a) está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el dominio de activación de NF-kappaB p65.
10. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 donde la endonucleasa de restricción codificada por el segundo casete (b) es I-SceI.
11. Un polinucleótido o vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que comprende el genoma de un adenovirus recombinante que carece de, al menos, la secuencia ? de empaquetamiento y la secuencia que codifica la proteína E1A o E1A/E1B, en donde dicha secuencia que comprende el genoma de un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de restricción.
12. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 11 que comprende además una secuencia nucleotídica de reconocimiento específico para una integrasa, donde la secuencia de reconocimiento para la integrasa se encuentra en posición 5' respecto de la primera secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción.
13. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicaciones 12 en donde la secuencia nucleotídica de reconocimiento para la integrasa es attB, específica para la integrasa PhiC31.
14. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en donde las secuencias nucleotídicas de reconocimiento para la endonucleasa son específicas para la endonucleasa I-SceI.
15. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
16. Una célula hospedadora según la reivindicación 15 que comprende, adicionalmente, una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1B.
17. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
18. Una célula hospedadora según la reivindicación 15 a 17 que comprende, adicionalmente, un polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o que es obtenible mediante integración en una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, de un polinucleótido según la reivindicaciones 11 a 14.
19. Una célula según la reivindicación 18 en donde las dianas de restricción que flanquean el genoma viral derivadas del polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 son reconocidas de forma específica por la endonucleasa de restricción que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) derivado del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
20. Un método para la producción de células adecuadas para la producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un adenovirus de alta capacidad que comprende
en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y en donde si las células se transfectan en la etapa (i) con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, entonces se utilizan células que comprenden la secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B.
21. Método según la reivindicación 20 en donde las etapas (i) y/o (ii) incluyen una etapa adicional de selección en la que se seleccionan células que han integrado de forma estable el primer y/o el segundo polinucleótido en base a marcadores de selección presentes en los polinucleótidos utilizados en las etapas (i) y (ii).
22. Método según la reivindicación 20 ó 21 en donde el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 comprende adicionalmente una secuencia nucleotídica de reconocimiento específico para una integrasa y en donde la transfección realizada en la etapa (ii) incluye, adicionalmente, un polinucleótido que codifica una integrasa específica para dichas secuencias de reconocimiento.
23. Método según la reivindicación 22 en donde la integrasa específica es la integrasa del fago PhiC31 de Streptomyces y en donde el sitio de reconocimiento específico es un sitio attB.
24. Célula obtenible mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
25. Un sistema para la producción de adenovirus de alta capacidad que comprende
26. Método para la producción de vectores adenovirales de alta capacidad, que comprende las etapas de:
en donde la célula hospedadora usada en la etapa (a) se selecciona del grupo de
27. Método según la reivindicación 26, donde el cultivo de la etapa (b) se realiza en presencia de un agente inductor específico del regulador transcripcional codificado por la secuencia nucleotídica comprendida en el polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 4 y 5 a 10.
28. Método según las reivindicación 27 en donde el regulador transcripcional está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el dominio de activación de NF-kappaB p65 y donde el agente inductor es una antiprogestina sintética, preferiblemente mifepristona.
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