Síntesis de un complejo bifuncional.

Un procedimiento de división y mezcla para generar una biblioteca de complejos bifuncionales que comprendeuna parte de molécula de presentación y una parte codificante,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

a) proporcionar en compartimentos separados complejos bifuncionales nacientes comprendiendo cada unoun sitio de reacción química y un sitio de cebado para la adición enzimática de una marca deoligonucleótidos;

b) realizar en cada compartimento, en cualquier orden, una reacción entre el sitio de reacción química yuno o más reactivos proporcionados en dicho compartimento de reacción usando una o más enzimas;

c) reunir el contenido de dos o más compartimentos y seguidamente dividir los contenidos reunidos en unamatriz de compartimentos para una nueva ronda de reacción;

d) realizar una nueva ronda de reacción, usando el producto final de una ronda precedente como complejobifuncional naciente, para obtener una biblioteca de complejos bifuncionales nacientes en la cual, cadamiembro de la biblioteca comprende producto de reacción específico de reactivo y marcas respectivas deoligonucleótido que codifican la identidad de cada uno de los reactivos que han participado en la formacióndel producto de reacción.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10183942.

Solicitante: NUEVOLUTION A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Rønnegade 8, 5th floor 2100 Copenhagen DINAMARCA.

Inventor/es: SAMS, CHRISTIAN, FELDING, JAKOB, PEDERSEN, HENRIK, FRESKGARD,Per-Ola, FRANCH,Thomas, GOULIAEV,Alex,Haahr, LUNDORF,Mikkel,Dybro, OLSEN,Eva,Kampmann, HOLTMANN,Anette, JAKOBSEN,Soren,Nyboe, GLAD,SANNE SCHRØDER, JENSEN,KIM BIRKEBÆK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07B61/00 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07B PROCESOS GENERALES DE QUIMICA ORGANICA; SUS APARATOS (preparación de ésteres de ácidos carboxílicos por telomerización C07C 67/47; procesos para la preparación de compuestos macromoleculares, p.ej. telomerzación C08F, C08G). › Otros procesos generales.
  • C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C40B40/06 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas que contienen nucleótidos o polinucleótidos, o sus derivados.

PDF original: ES-2452566_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Sintesis de un complejo bifuncional.

Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un complejo bifuncional que comprende parte de molécula de presentación y una parte codificante. La invención también se refiere a un procedimiento para la generación de una biblioteca de complejos bifuncionales, a un procedimiento para identificar una molécula de presentación que tiene una propiedad preseleccionada.

Antecedentes Se han desarrollado enfoques que permiten la codificación sintética de polipéptidos y otros polímeros bioquímicos. Un ejemplo de este enfoque se desvela en el documento US 5.723.598 que se refiere a la generación de una biblioteca de moléculas bifuncionales. Una parte del complejo bifuncional es el polipéptido y la otra parte es un oligonucleótido identificador que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica e identifica los aminoácidos que han participado en la formación del polipéptido. Tras la generación de la biblioteca de las moléculas bifuncionales se realiza una separación con respecto a la afinidad hacia una diana y la parte de oligonucleótido identificador de la molécula bifuncional se amplifica por medio de PCR. Eventualmente, los amplicones de PCR se secuencian y se descodifican para la identificación de los polipéptidos que tienen afinidad hacia la diana. La biblioteca de complejos bifuncionales se produce mediante un procedimiento comúnmente conocido como división y mezcla. El procedimiento implica que una molécula de ligador se divida en compartimentos separados espaciales y reaccione con un precursor de aminoácido específico en un extremo en cada compartimento y se añada una marca de ácido nucleico que codifica este precursor de aminoácido específico en el otro extremo por una reacción química ortogonal. Posteriormente, el contenido de los diversos compartimentos se recoge (se mezclan) y luego se dividen de nuevo en varios compartimentos para una nueva ronda de reacción alterna con precursor de aminoácido y marca de nucleótido. El procedimiento de división y mezcla continúa hasta que se alcanza la longitud deseada de polipéptido.

Este procedimiento de la técnica anterior está limitado en su aplicación debido a que debe haber químicas compatibles entre los dos procedimientos de síntesis alternos para añadir una unidad química con respecto al de añadir una secuencia de nucleótidos u oligonucleótidos. Según la técnica anterior, el problema de la compatibilidad de síntesis se resuelve por la correcta elección de grupos protectores compatibles a medida que se sintetizan polímeros alternos, y por la correcta elección de procedimientos para la desprotección de un polímero en crecimiento selectivamente mientras que el otro polímero en crecimiento permanece bloqueado.

Halpin y Harbur y han sugerido en el documento WO 00/23458 otro enfoque en el que las moléculas formadas no sólo se identifican, sino que también son dirigidas por la marca de ácido nucleico. El enfoque también se basa en la estrategia de división y mezcla para obtener bibliotecas combinatorias usando dos o más etapas sintéticas. Se usa una pluralidad de moldes de ácido nucleico, cada uno de los cuales tiene en un extremo un sitio reactivo químico y disperso por todo el sitio una pluralidad de regiones de codón, especificando cada una de dichas regiones de codón a su vez codones diferentes. Los moldes se separan por hibridación de los codones con una sonda inmovilizada y posteriormente cada una de las cadenas se hace reaccionar en los sitios de reacción química con reactivos seleccionados específicos. Posteriormente, todas las cadenas se reúnen y se someten a una segunda separación basada en una región del segundo codón. El procedimiento de división y mezcla se realiza un número de veces apropiado para producir una biblioteca de normalmente entre 103 y 106 compuestos diferentes. El procedimiento tiene la desventaja de que debe proporcionarse un gran número de moldes de ácido nucleico. En el caso de que se desee una biblioteca final de 106 compuestos diferentes debe sintetizarse un total de 106 moldes de ácido nucleico. La síntesis es generalmente engorrosa y cara debido a que los moldes de ácido nucleico deben ser de una longitud considerable para asegurar una hibridación suficiente entre la región de codón y la sonda.

En el documento WO 02/074929 se desvela un procedimiento para la síntesis de compuestos químicos. Los compuestos se sintetizan poniendo inicialmente en contacto una unidad de transferencia que comprende un anticodón y una unidad reactiva con un molde que tiene una unidad reactiva asociada al mismo en condiciones que permitan la hibridación del anti-codón al molde y posteriormente haciendo reaccionar las unidades reactivas. Por tanto, este procedimiento sufre la desventaja de que inicialmente debe proporcionarse un gran número de moldes de ácido nucleico.

Los procedimientos de la técnica anterior usando moldes sufren la desventaja de que la codificación depende del reconocimiento entre el anti-codón y el molde. La hibridación entre dos oligonucleótidos puede producirse en caso de que haya una complementariedad suficiente entre éstos. Ocasionalmente, la hibridación se producirá aún cuando no esté presente una coincidencia completa entre los oligonucleótidos. Entonces, el efecto es, en el caso de que esté presente una pluralidad de unidades de transferencia, que la secuencia de codones del molde no se corresponde algunas veces con la unidad reactiva realmente reaccionada. Este efecto no deseado es incluso más pronunciado cuando está prevista la formación de la biblioteca debido a una pluralidad de moldes y se supone que los bloques de construcción se encuentran en los medios de reacción. Si la etapa de hibridación no es completamente correcta, se generarán moléculas que están codificadas por los codones incorrectos en el molde. Esto tendrá dos efectos principales sobre el procedimiento de selección realizado en la biblioteca. Primero, los moldes con una combinación de codones que codifica ligandos de unión se perderán en el proceso de selección. En segundo lugar, y puede ser más importante, los moldes con una combinación de codones que codifica ligandos de no unión se enriquecerán.

En un aspecto de la presente invención un objeto es proporcionar un procedimiento no dependiente del molde para obtener una molécula codificada, permitiendo dicho procedimiento que se apliquen químicas versátiles en la formación de la molécula codificada debido a que puede evitarse la aplicación de grupos de protección ortogonales compatibles en la formación alterna de la molécula codificada y la marca de oligonucleótido. La presente invención intenta mejorar en un aspecto preferido el procedimiento de hibridación propenso a error previo sugerido en el procedimiento de reconocimiento de codones. Además, un objeto de la invención es reducir los productos de reacción no específicos formados. Por tanto, en un aspecto de la presente invención, el presente procedimiento tiene una facilidad de corrección inherente que asegura que el fenotipo esté codificado con exactitud por el genotipo.

Los documentos US 5.723.598 y Brenner & Lerner (“Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 89, 1992, pags. 5381-5383) describen métodos para sintetizar bibliotecas combinatorias marcadas que contienen un polímero químico y un oligonucleótido identificador que define al polímero químico. Las marcas de oligonucleótido son desprotegidas después de ser añadidas químicamente a un ligador o a otra marca de nucleótido.

El documento Kinoshita y Nishigaki (“Nucleic Acids Symposium Series, vol.34, 1995, pags. 201-202”) describe un método para la ligazón enzimática usando una ARN ligasa T4.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un complejo bifuncional que comprende una parte de molécula de presentación y una parte codificante, en el que un complejo bifuncional naciente que comprende un sitio reactivo químico y un sitio de cebado para la adición enzimática de una marca, se hace reaccionar en el sitio reactivo químico con uno o más reactivos, y está provisto de una (s) respectiva (s) marca (s) que identifica (n) el (los) reactivo (s) en el sitio reactivo químico usando una o más enzimas.

Las enzimas son en general específicas de sustrato, que supone que la adición enzimática de una marca al sitio de cebado no es probable que interfiera con la molécula de presentación que se forma. Por tanto, la aplicación de grupos de protección en la parte codificante, además de la molécula de presentación naciente, puede evitarse por este motivo. Sin embargo, puede desearse por otros motivos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de división y mezcla para generar una biblioteca de complejos bifuncionales que comprende una parte de molécula de presentación y una parte codificante, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

a) proporcionar en compartimentos separados complejos bifuncionales nacientes comprendiendo cada uno un sitio de reacción química y un sitio de cebado para la adición enzimática de una marca de oligonucleótidos; b) realizar en cada compartimento, en cualquier orden, una reacción entre el sitio de reacción química y uno o más reactivos proporcionados en dicho compartimento de reacción usando una o más enzimas; c) reunir el contenido de dos o más compartimentos y seguidamente dividir los contenidos reunidos en una matriz de compartimentos para una nueva ronda de reacción; d) realizar una nueva ronda de reacción, usando el producto final de una ronda precedente como complejo bifuncional naciente, para obtener una biblioteca de complejos bifuncionales nacientes en la cual, cada miembro de la biblioteca comprende producto de reacción específico de reactivo y marcas respectivas de oligonucleótido que codifican la identidad de cada uno de los reactivos que han participado en la formación del producto de reacción.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las marcas de oligonucleótido son bicatenarias durante una reacción del sitio de reacción química con uno o más reactivos.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dos o más marcas de oligonucleótido consisten en una estructura de esqueleto de ADN.

4. El procedimiento de la reivindicación3, en el que las marcas de oligonucleótido que consisten en una estructura de esqueleto de ADN son añadidas al sitio de cebado por una ADN ligasa.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la ligazón de las marcas de oligonucleótido se realiza en un estado bicatenario.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la enzima es una ADN ligasa T4 o una ADN ligasa Taq. .

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el quela parte codificante de los complejos bifuncionales consiste en ADN bicatenario..

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la parte codificante que comprende todas las marcas de oligonucleótido se transforma en una forma bicatenaria por un procedimiento de extensión en el que un cebador se hibrida con el extremo 3' del oligonucleótido y se extiende usando una polimerasa.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el procedimiento de extensión se realiza por una combinación de ligasa y polimerasa.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la librería contiene de 103 a 106 complejos bifuncionales.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la librería contiene de 103 a 1010 complejos bifuncionales.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, que comprende la etapa adicional de separar la biblioteca de los diferentes complejos bifuncionales, comprendiendo dicho método la etapa de fijar como diana una entidad diana y seleccionar de la biblioteca de complejos bifuncionales, aquellos complejos que tienen una afinidad por dicha diana .

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la selección se repite una o más veces adicionales.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que se inmoviliza la diana.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la etapa de separación implica cromatografía de exclusión por tamaño.

16. El procedimiento de la reivindicación 12, que comprende la etapa adicional de amplificar el identificador de oligonucleótido de los complejos bifuncionales seleccionados.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, que comprende la etapa adicional de secuenciar el identificador de oligonucleótido.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción Literatura no patente citada en la descripción


 

Patentes similares o relacionadas:

Secuenciación dirigida y filtrado de UID, del 15 de Julio de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Un procedimiento para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende: (a) generar una primera secuencia del complemento (CS) de un polinucleótido diana a partir […]

Método para romper un ácido nucleico y añadir un adaptador por medio de transposasa y reactivo, del 1 de Julio de 2020, de MGI Tech Co., Ltd: Un metodo para romper un acido nucleico y anadir un adaptador por medio de una transposasa, que comprende las siguientes etapas: interrumpir […]

Vacuna subunitaria contra Mycoplasma spp., del 1 de Julio de 2020, de Agricultural Technology Research Institute: Una composición para prevenir una infección por Mycoplasma spp., que comprende: un principio activo, que comprende una proteína de PdhA; y un adyuvante […]

Aislamiento de ácidos nucleicos, del 24 de Junio de 2020, de REVOLUGEN LIMITED: Un método de aislamiento de ácidos nucleicos que comprenden ADN de material biológico, comprendiendo el método las etapas que consisten en: (i) efectuar un lisado […]

Métodos y composiciones para escisión dirigida y recombinación, del 20 de Mayo de 2020, de Sangamo Therapeutics, Inc: Un método in vitro para la escisión selectiva de un gen HLA clase I, un gen HLA que codifica una proteína de clase 1 del Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC) […]

Proteínas de captura de la superficie celular recombinantes, del 13 de Mayo de 2020, de REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.: Un método para detectar y aislar células que producen altos niveles de una proteína heterodimérica que tiene una primera subunidad y una segunda subunidad, […]

Etiquetado y evaluación de una secuencia diana, del 13 de Mayo de 2020, de RhoDx, Inc: Un método para modificar un ácido nucleico, que comprende: (a) poner en contacto un ácido nucleico de cadena sencilla con una actividad de transferasa […]

Preparación de bibliotecas de ácido nucleico marcado usando protocolo de adición en un solo tubo, del 13 de Mayo de 2020, de ILLUMINA, INC: Un método para preparar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico marcados que comprende: (a) poner en contacto una célula individual […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .