SÍNTESIS DE PÉPTIDOS EN FASE SÓLIDA.

Procedimiento para la preparación de un derivado péptido o sal del mismo,

de fórmula: en la que Tos representa p-toluenosulfonilo, que comprende: a) el acoplamiento consecutivo de los aminoácidos arginina, prolina y glicina en una fase sólida de soporte en presencia del sistema de agente de acoplamiento/aditivo, b) la tosilación del grupo N-α-amino de la glicina, c) la escisión del péptido tosilado o de un derivado del mismo con cadena lateral amino protegida, de la fase sólida de soporte, d) la reacción del intermediario péptido de fórmula: o de un derivado del mismo con cadena lateral amino protegida por una anilina de fórmula: R-NH 2 III en la que R representa p-aminofenilo y en la que un grupo amino se encuentra protegido por un grupo protector de amino, en presencia de un sistema de agente de acoplamiento/aditivo

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un derivado péptido de fórmula:

5

en la que Tos representa p-toluenosulfonilo.

El procedimiento de la presente invención se basa en la síntesis en fase sólida. Durante la síntesis en fase sólida, se ensamblan (es decir, se acoplan) aminoácidos formando un péptido de cualquier secuencia deseada, mientras que el material de partida se une a un soporte sólido inerte. Se añaden reactivos en solución; debido a que el producto de partida se encuentra unido al sólido, cualquier producto del material de partida también permanece unido. Tras unir la 10 secuencia deseada sobre el soporte, se desengancha el péptido (es decir, se escinde) del soporte.

Los derivados péptidos producidos según la presente invención resultan adecuados para la determinación cuantitativa de determinados enzimas proteolíticos de clase EC 3.4.4 y especialmente para la trombina (EC es la abreviatura para "Enzyme Committee", de la International Union of Biochemistry). 15

Se han descrito métodos para la síntesis de dichos péptidos relacionados en, por ejemplo, las patentes US nº 4.428.874 (1984), nº 4.070.245 (1978) y nº 4.629.695 (1986). Estos métodos se basan en la síntesis en fase solución utilizando diferentes derivados de aminoácidos.

20 La publicación de patente internacional WO nº 86/01209 da a conocer péptidos p-fenilendiamina para la determinación de proteasas del sistema de coagulación sanguínea.

La publicación de patente europea EP nº 0 182 373 A2 describe un ensayo de coagulación sanguínea en tiras reactivas utilizando Tos-Gly-Pro-Arg-p-fenilendiamina como reactivo. 25

La publicación de patente europea EP nº 0 285 000 A2 da a conocer compuestos cromogeno y su utilización como sustratos enzimáticos.

Sin embargo, los métodos descritos en la técnica no resultan satisfactorios con respecto a la pureza óptica del isómero 30 deseado y con respecto a los esfuerzos necesarios para la purificación de los péptidos respectivos.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento más económico para la preparación del derivado péptido de fórmula 1 con un buen rendimiento y elevada pureza óptica.

35 El objetivo se ha conseguido utilizando el procedimiento de la presente invención según la reivindicación 1. El procedimiento comprende:

a) el acoplamiento consecutivo de los aminoácidos arginina, prolina y glicina en un soporte de fase sólida en presencia de un sistema de agente de acoplamiento/aditivo. 40

b) la tosilación del grupo N-α-amino de la glicina,

c) la escisión del péptido tosilado o de un derivado del mismo con cadena lateral amino protegida de la fase sólida de soporte,

d) reacción del péptido intermediario de la fórmula

o de un derivado del mismo con cadena lateral amino protegida por una anilina de fórmula:

R-NH2 III 5

en la que R representa p-aminofenilo y en la que un grupo amino se encuentra protegido con un grupo protector de amino, en presencia de un sistema de agente de acoplamiento/aditivo.

El significado de las abreviaturas utilizadas en la descripción y en las reivindicaciones es el descrito generalmente en la tabla a continuación: 10

Fmoc

9-Fluorenilmetoxicarbonilo

Boc

t-Butoxicarbonilo

Tos

4-Toluenosulfonilo

DIEA

Diisopropiletilamina

NMP

N-Metilpirrolidona

DCM

Diclorometano

TFA

Ácido trifluoroacético

DMF

N,N'-Dimetilformamida

HBTU

N,N,N',N'-tetrametil-uronio-hexafluorofosfato de O-benzotriazol

HOBt

1-Hidroxibenzotriazol

HOOBt

3,4-Dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina

DEPBT

3-(Dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazín-4(3H)-ona

PyBOP

Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio

CTC

Cloruro de 2-clortritilo

DCC

N,N'-Diciclohexilcarbodiimida

TBTU

Tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

HOAt

1-Hidroxi-7-azabenzotriazol

Pbf

5-Sulfonil-2,2,4,6,7-pentametilbenzofurano

Pmc

6-Sulfonil-2,2,5,7,8-pentametilcromano

Et3N

Trietilamina

Se entiende además que los aminoácidos arginina y prolina pueden utilizarse en su configuración L o en su configuración D, como racemato, o en diversas mezclas de sus isómeros. Preferentemente los aminoácidos se utilizan en su configuración L.

El acoplamiento consecutivo en la etapa a) de la presente invención comprende en una primera etapa la unión de una 5 arginina preferentemente protegida a una fase sólida de soporte.

El grupo α-amino de la arginina puede protegerse con un grupo protector de amino común conocido por el experto en la materia. El grupo α-amino protector preferente de la arginina es Fmoc.

La cadena lateral, es decir, la parte guanidina de la molécula de arginina, como regla general se encuentra protegido con un grupo protector de cadena lateral de arginina conocido por el experto en la materia. Un grupo protector preferente de 10 cadena lateral de arginina es Pmc o Pbf, más preferentemente Pbf.

En principio, puede utilizarse para la síntesis de la presente invención cualquier fase sólida de soporte que sea conocido que resulte útil para la síntesis de péptidos en fase sólida, tal como se describe en Peptides: Chemistry and Biology, N. Sewald, H. D. Jakubke, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2002, y en Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis-A practical approach, W.C. Chan, P.D. White, Oxford University Press Inc. New York, 2000. 15

Se ha encontrado que las resinas de 2-clorotritilcloruro-poliestireno (resinas CTC) son las más adecuadas como fase sólida de soporte para el propósito de la síntesis de péptidos de la presente invención. Las resinas CTC se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de Merck Bioscience.

La arginina protegida preferentemente se disuelve en un solvente inerte, tal como, por ejemplo, diclorometano. 20

Habitualmente se encuentra presente una amina terciaria, tal como Et3N, DIEA o sim-colidina, preferentemente DIEA o sim-colidina.

La unión a la fase sólida de soporte como regla general ocurre a temperatura ambiente. 25

El tratamiento de la resina cargada se realiza según técnicas conocidas por el experto en la materia, e incluye el lavado de la resina con solventes orgánicos, la filtración y finalmente el secado a temperaturas moderadas.

En una realización preferente de dicha primera etapa, se prepara resina CTC cargada con Fmoc-Arg(Pbf)-OH. 30

En las etapas siguientes, se lleva a cabo el acoplamiento con la prolina protegida, seguido del acoplamiento con la glicina protegida.

Antes de que pueda tener lugar el acoplamiento, el grupo α-amino de la arginina debe desprotegerse rápidamente 35 utilizando una amina secundaria, tal como morfolina, DBU o piperidina, preferentemente con piperidina en una solución al 5-20% con un solvente adecuado, tal como DMF o NMP, preferentemente con NMP.

Los grupos α-amino de tanto prolina como glicina pueden protegerse con un grupo protector de amino común conocido por el experto en la materia. Fmoc es el grupo protector de α-amino preferente para tanto la prolina como la glicina. 40

La prolina puede aplicarse en forma de un derivado activado seleccionado de entre PG-Pro-OPfp, PG-Pro-OSu y PG-Pro-OBt, o en forma de un derivado no activado en forma de PG-Pro-OH, en la que PG representa un grupo protector... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de un derivado péptido o sal del mismo, de fórmula:

en la que Tos representa p-toluenosulfonilo, que comprende:

a) el acoplamiento consecutivo de los aminoácidos arginina, prolina y glicina en una fase sólida de soporte en 5 presencia del sistema de agente de acoplamiento/aditivo,

b) la tosilación del grupo N-α-amino de la glicina,

c) la escisión del péptido tosilado o de un derivado del mismo con cadena lateral amino protegida, de la fase sólida de soporte,

d) la reacción del intermediario péptido de fórmula: 10

o de un derivado del mismo con cadena lateral amino protegida por una anilina de fórmula:

R-NH2 III 15

en la que R representa p-aminofenilo y en la que un grupo amino se encuentra protegido por un grupo protector de amino, en presencia de un sistema de agente de acoplamiento/aditivo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la fase sólida de soporte es una resina de 2-clorotritilcloruro-poliestireno.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la arginina presenta una cadena lateral protegida 20 por un grupo protector Pbf o Pmc.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la prolina se aplica en forma de un derivado activado seleccionado de entre PG-Pro-OPfp, PG-Pro-OSu y PG-Pro-OBt, o no activado en forma de PG-Pro-OH, en el que PG representa un grupo protector de amino.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque se aplica la prolina en forma de Fmoc-(L)-Pro-OH.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la glicina se aplica en forma de un derivado activado seleccionado de entre PG-Gly-OPfp, PG-Gly-OSu y PG-Gly-OBt, o no activado en forma de PG-Gly-OH, en el que PG representa un grupo protector de amino.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque se aplica la glicina en forma de Fmoc-Gly-OH. 5

8. Procedimiento según las reivindicaciones 5 y 7, caracterizado porque el grupo protector Fmoc se elimina mediante tratamiento con piperidina.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el sistema de agente de acoplamiento/aditivo para el acoplamiento consecutivo de los aminoácidos en la etapa a) se selecciona de entre DCC/HOBt, HBTU/HOBt, TBTU/HOBt, HATU/HOAt DEPBT/ HOOBt y PyBoP/Cl-HOBt. 10

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el sistema de agente de acoplamiento aditivo es HBTU/HOBt.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el sistema de agente de acoplamiento/aditivo para la reacción del intermediario péptido de fórmula II con la anilina de fórmula III se selecciona de entre DCC/HOBt, HATU/HOAt, HBTU/ HOBt, TBTU/HOBt, PyBOP/Cl-HOBt y DEPBT/HOOBt. 15

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el sistema de agente de acoplamiento/aditivo es DEPBT/HOOBt.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la tosilación tiene lugar con cloruro de 4-toluenosulfonilo.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la escisión de la fase sólida de soporte se lleva a 20 cabo con ácido trifluoroacético.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción con la anilina de fórmula III en la etapa d) se lleva a cabo con Tos-Gly-Pro-Arg(Pbf)-OH como derivado con cadena lateral amino protegida del intermediario péptido de fórmula II.