Un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con actividad de N-succinil-aminocetopimelato transaminasa,

que comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEQ ID NO

Secuencias de nucleótidos que codifican el gen dapC, y procedimiento para la preparación de L-lisina.

Son objeto del invento unas secuencias de nucleótidos que codifican el gen dapC y procedimientos para la preparación por fermentación de L-lisina mediando utilización de bacterias corineformes, en las que es sobreexpresado el gen dapC (gen de N-succinil-aminocetopimelato transaminasa).

Estado de la técnica

Ciertos aminoácidos, en particular la L-lisina, encuentran utilización en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero especialmente en la nutrición de animales.

Es conocido que se preparan aminoácidos mediante fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia, se trabaja constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de preparación. Unas mejoras en los procedimientos pueden referirse a medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos tal como p.ej. a la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante p.ej. una cromatografía de intercambio de iones, o las propiedades intrínsecas de rendimiento del propio microorganismo.

Con el fin de mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan métodos de la mutagénesis, la selección y la elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes contra anti-metabolitos, tales como p.ej. el compuesto análogo a lisina S-(2-amino-etil)cisteína, o son auxótrofas para metabolitos importantes en cuanto a regulación y producen unos L-aminoácidos tales como p.ej. L-lisina.

Desde hace algunos años, se emplean asimismo métodos de la tecnología del ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Corynebacterium que producen aminoácidos, amplificando unos genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigando la repercusión sobre la producción de los aminoácidos. Unos artículos recopilatorios acerca de esto se encuentran, entre otras, en las citas de Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria" [Bacterias de ácido glutámico], en: Biology of Industrial Microorganisms, de Demain y Solomon (coordinadores de edición), Benjamin Cummings, Londres, Reino Unido, 1985, 115-142), de Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), de Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)), de Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y de Sahm y colaboradores (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

Misión del invento

Los autores del invento se han establecido como misión la de poner a disposición unas nuevas medidas para la preparación por fermentación mejorada de L-lisina.

Descripción del invento

La L-lisina encuentra utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica y en particular en la nutrición de animales. Existe por lo tanto un interés general en poner a disposición nuevos procedimientos mejorados para la preparación de L-lisina.

Cuando en lo sucesivo se mencionan la L-lisina o la lisina, se entienden por estos nombres no solamente la base, sino también las sales tales como p.ej. el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina.

Es objeto del invento un polinucleótido aislado a partir de bacterias corineformes, que contiene por lo menos una secuencia de polinucleótido, seleccionado entre el conjunto formado por

Es objeto del invento asimismo el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, tratándose de manera preferente de un ADN replicable, que contiene:

Otros objetos del invento son

Son objeto del invento asimismo unos polinucleótidos, que se componen en lo esencial de una secuencia de polinucleótido, los cuales son obtenibles por escrutinio mediante hibridación de un correspondiente banco de genes, que contienen el gen completo con la secuencia de polinucleótido que corresponde a SEQ ID No. 1, con una sonda, que contiene la secuencia de polinucleótido que se menciona según SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma, y por aislamiento de la mencionada secuencia de ADN.

Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con el invento son apropiadas como sondas de hibridación para ARN, ADNc y ADN, con el fin de aislar un ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) de plena longitud, que codifican la N-succinil-aminocetopimelato transaminasa y aislar tales ADNc o unos genes, que presentan una alta similaridad de su secuencia con la del gen N-succinil-aminocetopimelato transaminasa.

Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con el invento son apropiadas además como cebadores para la producción de los ADN de genes que codifican la N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acrónimo de Polymerase Chain Reaction).

Tales oligonucleótidos, que sirven como sondas o cebadores, contienen por lo menos 30, de manera preferida por lo menos 20, de manera muy especialmente preferida por lo menos 15 nucleótidos consecutivos. Son apropiados asimismo unos oligonucleótidos que tienen una longitud de por lo menos 40 ó 50 nucleótidos.

El concepto de "aislado" significa separado desde su entorno natural.

El concepto de "polinucleótido" se refiere en general a poli(ribonucleótidos) y poli-(desoxirribonucleótidos), pudiéndose tratar de un ARN o ADN no modificado o de un ARN o ADN modificado.

Por el concepto de "polipéptidos" se entienden unos péptidos o unas proteínas que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.

Los polipéptidos de acuerdo con el invento incluyen un polipéptido de acuerdo con SEQ ID No. 2, en particular los que tienen la actividad biológica de la N-succinil-aminocetopimelato transaminasa y también los que presentan una identidad desde por lo menos un 90% hasta un 95% con el polipéptido de acuerdo con SEQ ID No. 2, y la actividad mencionada.

El invento se refiere además a un procedimiento para la preparación por fermentación de L-lisina, mediando utilización de bacterias corineformes, que en particular ya producían un aminoácido, y en las cuales se refuerzan, en particular se sobreexpresan las secuencias de nucleótidos que codifican el gen dapC.

El concepto de "refuerzo" describe en este contexto la elevación de la actividad intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el correspondiente ADN, aumentando por ejemplo el número de copias del gen o respectivamente de los genes, utilizando...

1. Un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con actividad de N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, que comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEQ ID NO. 2.

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es idéntica en por lo menos un 95% a la secuencia de SEQ ID NO. 2.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,

caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de SEQ ID NO. 2.

4. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3,

caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de las posiciones desde 91 hasta 1.191 de SEQ ID NO. 1.

5. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4,

caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de SEQ ID NO. 1.

6. Un polinucleótido aislado, que es complementario con respecto a los polinucleótidos de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 5.

7. Un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 6.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7,

caracterizado porque se trata del pXT-dapCexp, depositado bajo la denominación DSM 13254.

9. Una bacteria corineforme o una bacteria de la especie Escherichia coli, en la que el vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 ha sido transformado por conjugación o transformación.

10. Una bacteria corineforme recombinante, en la que se presenta aumentada la actividad intracelular de la N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, consiguiéndose el aumento mencionado mediante sobreexpresión de un polinucleótido, que codifica un polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en por lo menos un 90% a la de SEQ ID NO. 2, y consiguiéndose la sobreexpresión mediante aumento del número de copias o mediante utilización de un promotor fuerte.

11. Una bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 10,

caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del péptido es idéntica en por lo menos un 95% a la de SEQ ID NO. 2.

12. Una bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 11,

caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la de SEQ ID NO. 2.

13. Una bacteria corineforme de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 hasta 12,

caracterizada porque se trata del género Corynebacterium.

14. Una bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 13,

caracterizada porque se trata de la especie Corynebacterium glutamicum.

15. Una bacteria corineforme de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 9 hasta 14,

caracterizada porque se trata de una mutante productora de L-lisina.

16. Un procedimiento para la preparación de L-lisina,

caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16,

caracterizado porque se fermentan unas bacterias, en las que se sobreexpresa(n) uno o varios de los genes, seleccionados entre el conjunto formado por

18. Un ADN que procede de bacterias corineformes, que codifica una proteína enzimática N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, cuya secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 2) contiene en la posición 209 cualquier otro aminoácido distinto, estando excluida la L-prolina.

19. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque éste codifica una proteína enzimática N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, cuya secuencia de aminoácidos contiene en la posición 209 L-leucina, que se representa en SEQ ID NO. 4.

20. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque éste contiene en la posición 716 la nucleobase timina, que se representa en SEQ ID NO. 3.

21. Bacterias corineformes recombinantes que contienen un ADN de acuerdo con las reivindicaciones 18, 19 ó 20.

22. Un procedimiento para la preparación de L-lisina de acuerdo con la reivindicación 16,

caracterizado porque en la etapa a) se emplean las bacterias de acuerdo con la reivindicación 21.