SECUENCIAS LIDERES PARA USO EN LA PRODUCCION DE PROTEINAS.

Una construcción de ADN que comprende una secuencia que codifica un pre-pro péptido IgSP-tPA que comprende un péptido señal de inmunoglobulina (IgSP) unido a un pro péptido activador de plasminógeno de tipo tejido (tPA) que consiste en los aminoácidos 23 a 32 de SEQ ID NO:

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04052302EP.

Solicitante: MERCK SERONO SA.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: CENTRE INDUSTRIEL,1267 COINSINS, VAUD.

Inventor/es: DUPRAZ,PHILIPPE, KOBR,MICHEL.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 11 de Noviembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/715B
  • C07K14/715G
  • C12N15/62A
  • C12P21/06 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.

Clasificación PCT:

  • C12N15/58 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Activadores de plasminógeno, p. ej. uroquinasa, ATP.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

Clasificación antigua:

  • C12N15/58 C12N 15/00 […] › Activadores de plasminógeno, p. ej. uroquinasa, ATP.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Fragmento de la descripción:

Secuencias líderes para uso en la producción de proteínas.

Breve descripción de la invención

Esta invención se refiere a secuencias líder para la producción de proteínas. Más específicamente, la invención se refiere a construcciones de ADN que codifican secuencias líder que comprenden un péptido señal de inmunoglobulina unido a un pro péptido activador de plasminógeno de tipo tejido. La invención además se refiere al uso de estas construcciones de ADN para producir proteínas en células de mamífero.

Antecedentes

1. Procesamiento de precursores de proteína

Las proteínas secretadas se expresan inicialmente dentro de la célula en una forma precursora que contiene una secuencia líder que asegura la entrada dentro de la ruta secretora. Tales secuencias líder, denominadas péptidos señal, dirigen al producto expresado a través de la membrana del retículo endoplásmico (RE). Generalmente, los péptidos señal son escindidos por peptidasas señal durante la translocación al RE. Una vez dentro de la ruta secretora, la proteína es transportada al aparato de Golgi. A partir del aparato de Golgi la proteína puede seguir diferentes rutas que llevan a compartimentos tales como la vacuola celular o la membrana celular, o puede ser dirigida fuera de la célula para ser secretada al medio externo (Pfeffer y Rothman (9187) Ann. Rev. Biochem. 56:829-852).

Para la producción industrial de una proteína secretada, la proteína a ser producida necesita ser secretada de forma eficaz de la célula hospedadora o del organismo hospedador. El péptido señal puede ser, por ejemplo, el péptido señal natural de la proteína a ser producida, un péptido señal heterólogo, o un híbrido de péptido señal natural y heterólogo. Numerosos péptidos señal son usados para la producción de proteínas secretadas. Uno de ellos es un péptido señal de inmunoglobulina de múrido (IgSP, EMBL No. De Acceso M13331). IgSP primero se identificó en 1983 por Loh et al. (Cell 33:85-93). IgSP es conocido por dar una buena expresión en células de mamífero. Por ejemplo, la patente EP No. 0382762 describe un método para producir peroxidasa de rábano picante construyendo un polipéptido de fusión entre IgSP y peroxidasa de rábano picante, y el documento WO 00/47741 describe la expresión recombinante de leptina en células COS y/o CHO usando varias secuencias señal, entre otras la secuencia señal de IgG1 de ratón.

Si embargo, se encuentran varios problemas con el uso de péptidos señal actualmente conocidos. Un problema que a menudo se encuentra cuando se produce una proteína humana a partir de una célula hospedadora u organismo no humano es que el péptido señal natural no asegura la translocación y/o la escisión eficaz del péptido señal. Esto lleva a bajas relaciones de secreción de proteína y/o a la secreción de proteínas maduras que exponen extensiones N-terminales debido a una escisión incorrecta del péptido señal. Por ello, la elección del péptido señal es de gran importancia para la producción industrial de una proteína.

Además de secuencias líder que dirigen la secreción de la proteína, una forma precursora puede comprender secuencias líder suplementarias que se escinden durante la maduración. Estos péptidos líder suplementarios, denominados pro péptidos, normalmente siguen al péptido señal. Virtualmente todas las hormonas peptídicas, numerosas proteínas bioactivas (por ejemplo, factores de crecimiento, receptores y moléculas de adhesión celular), y muchas toxinas bacterianas y glicoproteínas de envoltura viral comprenden un propéptido que es escindido de forma post-traduccional para generar la proteína madura y biológicamente activa (Seidah y Chretien (1999) Brain Res. 848:45-62).

Los pro péptidos son escindidos por enzimas denominadas convertasas de pro proteínas. Las convertasas de pro proteínas incluyen, por ejemplo, las convertasas de subtilisina PCSK1, PCSK2 y furina. La furina se expresa de forma ubicua y se localiza en la red trans del Golgi. La furina activa de forma proteolítica un gran número de sustratos de pro proteínas en los compartimentos de las rutas secretoras. (Thomas (2002) Nat Rev Mol Cell Biol. 3:753-766). Mas específicamente, la furina se localiza en la Red Trans del Golgi. Una estructura tardía del Golgi que es responsable de clasificar proteínas de la ruta secretora a sus destinos finales, incluyendo la superficie celular, los endosomas, los lisosomas y los gránulos secretores. El lugar que escinde la furina ha sido estudiado de forma extensa. El lugar de escisión está posicionado tras la arginina carboxilo terminal de la secuencia consenso R-X-L/R-R, donde X puede representar cualquier aminoácido (Nakayama (1997) Biochem. J 327:625-635). La eficacia de escisión está aumentada cuando X es una lisina, una valina, una isoleucina o una alanina (Watanabe et al (1992) J Biol. Chem. 267:8270-8274).

2. El precursor activador del plasminógeno de tipo tejido

El precursor activador del plasminógeno humano de tipo tejido (tPA, No. de Acceso Suizo P00750) es sintetizado como forma precursora de 562 aminoácidos que comprende una secuencia líder de 35 aminoácidos. Esta secuencia líder comprende un péptido señal de 23 aminoácidos seguido de un pro péptido de 12 aminoácidos.

Köhne et al. (1999, J. Cell. Biochem. 75:446-461) mostraron que la secuencia líder de tPA de 35 aminoácidos era capaz de rescatar el transporte celular de un quimérico de Receptor de Factor de Necrosis Tumoral-proteína de Inmunoglobulina (TNFR-Ig) en el que todos los lugares de glicosilación unidos al extremo N terminal se deleccionaron. En 1999, Etcheverry et al. describieron que una secuencia líder de 13 aminoácidos, que comprendía el último aminoácido del péptido señal y el pro péptido entero de tPA, era capaz de potenciar la secreción de un TNFR-Ig de fusión cuando se insertan entre el péptido señal de TNFR natural y el polipéptido TNRF-Ig (Etcheverry et al., ESACT meeting, Resumen O1.07/P1.02).

Por ello, el procesamiento de proteínas es un proceso fundamental para la eficaz secreción de las proteínas, y la elección de la secuencia líder es una etapa crítica cuando se produce un polipéptido secretado. En muchos casos, la secuencia líder lleva a un bajo nivel de secreción o no secreción, o a un procesamiento proteolítico incorrecto o incompleto. Por ello, es el objeto de la presente invención el proporcionar secuencias líder que aseguren una eficaz secreción y/o procesamiento de polipéptidos.

Compendio de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que una secuencia líder que comprende un péptido señal de inmunoglobulina unido a un pro péptido activador de plasminógeno de tipo tejido permite una secreción y procesamiento más eficaces de proteínas de interés que otras secuencias líder conocidas. Además, se ha encontrado que una secuencia líder que comprende una forma truncada del pro péptido de tPA humano, donde la extremidad carboxilo terminal del pro péptido de tPA consiste en los aminoácidos Arg-Xaa-Arg-Arg, permite una secreción y procesamiento eficaces de las proteínas de interés.

Por ello, un primer aspecto de la invención se refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia que codifica un pre-pro péptido IgSP-tPA que comprende un péptido señal de inmunoglobulina unido a un pro péptido de tPA que consiste en los aminoácidos 23 a 32 de SEQ ID NO: 2.

Un segundo aspecto se refiere a una célula hospedadora transformada con una construcción de ADN según la invención.

Un tercer aspecto se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de transfectar una célula hospedadora con una construcción de ADN según la invención.

Un cuarto aspecto se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadora de la invención.

Un quinto aspecto se refiere al uso de una construcción de ADN según la invención para producir un polipéptido de interés.

Un sexto aspecto se refiere a un polipéptido de fusión codificado por una construcción de ADN según la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una alineación entre un pre-pro péptido IgSP según la invención (SEQ ID NO: 1) y al pre-pro péptido tPA natural (SEQ ID NO: 2).

La Figura 2 muestra un esquema del vector pGL3-GH-TBP-1380 usado para construir el péptido señal...

 


Reivindicaciones:

1. Una construcción de ADN que comprende una secuencia que codifica un pre-pro péptido IgSP-tPA que comprende un péptido señal de inmunoglobulina (IgSP) unido a un pro péptido activador de plasminógeno de tipo tejido (tPA) que consiste en los aminoácidos 23 a 32 de SEQ ID NO: 2.

2. La construcción de ADN de la reivindicación 1, donde dicho péptido señal de inmunoglobulina es un péptido señal de inmunoglobulina de múrido.

3. La construcción de ADN de la reivindicación 2, donde dicho péptido señal de inmunoglobulina de múrido comprende SEQ ID NO: 3.

4. La construcción de ADN de la reivindicación 3, donde dicho pre-pro péptido comprende SEQ ID NO: 1.

5. La construcción de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha construcción de ADN codifica un polipéptido de fusión que comprende dicho pre-pro péptido IgSP-tPA unido a un polipéptido de interés.

6. La construcción de ADN de una de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha construcción de ADN está incluida en un vector.

7. La construcción de ADN de la reivindicación 6, donde dicho vector es un vector de expresión.

8. La construcción de ADN de la reivindicación 6, donde dicho vector es un vector para llevar a cabo la activación de genes.

9. Una célula hospedadora transformada con la construcción de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 9, donde dicha célula es seleccionada del grupo que consiste en una célula CHO, una célula COS, una célula CV1, una célula L de ratón, una célula HT1080, una célula BHK, una célula HEK293, una célula NIH-3T3, una célula LM, y una célula YI, N20 y SP2/0 de hibridoma de ratón y similares, Namalwa, RPMI-8226, Vero, WI-38, MRC-5 y similares.

11. La célula hospedadora de la reivindicación 9, donde dicha célula es una célula CHO:

12. Un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de transfectar una célula hospedadora con la construcción de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

14. El proceso de la reivindicación 12 o 13, que además comprende la etapa de aislar el polipéptido de interés de dichas células hospedadoras.

15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la transfección es transfección estable.

16. Uso de la construcción de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para producir un polipéptido de interés.

17. Un polipéptido de fusión codificado por la construcción de ADN de la reivindicación 5.


 

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