Métodos y secuencias para la detección e identificación de cepas de Staphylococcus aureus MREJ tipo v resistentes a meticilina.

Un método para detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) con MREJ de tipos i,

ii, iii y v, que comprende:

a) poner en contacto una muestra en la que hay que analizar la presencia de dichas cepas de SARM con MREJ de tipo i, ii, iii y v, en donde dichas cepas de SARM incluyen un elemento del casete cromosómico estafilocócico de mec (SCCmec) que contiene un gen mecA insertado en el ADN cromosómico, mediante lo cual se genera una secuencia de unión en el extremo derecho (MREJ, por su nombre en inglés) polimórfica de tipos i, ii, iii o v que comprende secuencias procedentes tanto del extremo derecho del elemento SCCmec como del ADN cromosómico adjunto al extremo derecho del elemento SCCmec con un primer y un segundo cebador para cada dicho MREJ de tipos i, ii, iii y v,

en donde dicho primer cebador se hibrida con dicho extremo derecho del elemento SCCmec de una secuencia de MREJ de tipo i, ii, iii o v seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID n.º 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, las SEQ ID n.º 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, las SEQ ID n.º 4 a 16, 104, 184 y 198, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y la SEQ ID n.º 47 a 50, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo v; y en donde cada dicho segundo cebador se hibrida con una secuencia cromosómica de S. aureus para generar específicamente uno o varios amplicones si tal cepa de SARM con MREJ de tipo i, ii, iii o v está presente en dicha muestra; y

b) detectar la presencia de dicho uno o varios amplicones.

Métodos y secuencias para la detección e identificación de cepas de Staphylococcus aureus MREJ tipo v resistentes a meticilina

Antecedentes de la invención

Importancia clínica del Staphylococcus aureus

La especie Staphylococcus aureus que contiene coagulasa está bien descrito que se trata de un patógeno oportunista humano. Las infecciones intrahospitalarias ocasionadas por S. aureus son una causa importante de morbimortalidad. Algunas de las infecciones más habituales ocasionadas por S. aureus afectan a la piel e incluyen forúnculos o diviesos, celulitis, ¡mpétigo e infecciones de heridas posoperatorias en varios sitios. Algunas de las infecciones más graves producidas por S. aureus son bacteriemia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, dermatitis exfoliativa neonatal y diferentes abscesos. La intoxicación alimentaria mediada por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante relacionado con S. aureus. El síndrome del choque tóxico, una enfermedad adquirida fuera del hospital, también se ha atribuido a la infección o colonización por S. aureus toxigénico (Murray et al., Eds., 1999, Manual ofClinical Microbiology, 7.a ed., ASM Press, Washington, D. C.).

En los años ochenta surgió en los hospitales el problema epidemiológico y clínico importante de S. aureus resistentes a la meticilina (SARM). Los SARM son resistentes a todos los (3-lactámicos, entre ellos las penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos, que son los antibióticos utilizados con más frecuencia para curar las infecciones por S. aureus. Las infecciones por SARM sólo se pueden tratar con antibióticos más costosos y más tóxicos, que normalmente se utilizan como la última línea de defensa. Dado que los SARM consiguen extenderse con facilidad de un paciente a otro a través del personal, los hospitales de todo el mundo se enfrentan con el problema de controlar los SARM. Por lo tanto, es necesario desarrollar pruebas sencillas y rápidas de diagnóstico y de detección para detectar y/o identificar los SARM con el objetivo de reducir su diseminación y mejorar el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes infectados.

La resistencia a la meticilina en S. aureus es única porque se debe a la adquisición del ADN de otros Staphylococcus sin coagulasa (o coagulasa-negativos, SCN) que codifica la proteína supernumeraria de unión a la penicilina resistente a los p-lactámicos (PBP, por su nombre en inglés), que se encarga de las funciones biosintéticas de las PBP normales cuando la célula está expuesta a los antibióticos p-lactámicos. S. aureus normalmente contiene cuatro PBP, de las cuales las PBP 1, 2 y 3 son esenciales. La PBP de baja afinidad en los SARM, denominada PBP 2a (o PBP2'), está codificada por el gen cromosómico mecA y funciona como una transpeptidasa resistente a los p-lactámicos. El gen mecA está ausente en los S. aureus sensibles a la meticilina, pero está ampliamente distribuido entre otras especies de estafilococos y está muy conservado (Ubukata et al., 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34: 170-172).

Cuando se determinó la secuencia nucleotídica de la región del ADN que rodea al gen mecA de la cepa N315 de S. aureus (aislada en Japón en 1982), Hiramatsu et al. hallaron que el gen mecA se alberga en un nuevo elemento genético, denominado casete cromosómico estafilocócico de mee (SCCmee, por su nombre en inglés), insertado en el cromosoma. SCC mee es un elemento genético móvil caracterizado por la presencia de repeticiones directas e inversas terminales, un conjunto de genes de recombinasas específicas de sitio (ccrA y ccrB) y el complejo génico mecA (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents. Chemother. 43: 1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1549-1555). El elemento se escinde con precisión del cromosoma de la cepa N315 de S. aureus y se integra en un sitio cromosómico específico de S. aureus en la misma orientación mediante la función de un conjunto único de genes de recombinasas que comprenden ccrA y ccrB. Se encontraron dos nuevos elementos genéticos de SSCmec que compartían características estructurales similares cuando se clonó y secuenció la región del ADN que rodeaba el gen mecA de las cepas de SARM NCTC 10442 (la primera cepa de SARM aislada en Inglaterra en 1961) y 85/2082 (una cepa de Nueva Zelanda aislada en 1985). Los tres SCC mee se han denominado tipo I (NCTC 10442), tipo II (N315) y tipo III (85/2082) basándose en el año de aislamiento de las cepas (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents. Chemother. 45: 1323-1336) (figura 1). Hiramatsu et al. han encontrado que los ADN de SSCmec están integrados en un sitio específico del cromosoma de S. aureus sensible a la meticilina (SASM). Caracterizaron las secuencias nucleotídicas de las regiones que flanqueaban los extremos izquierdo y derecho del ADN de SCC mee (a saber, attL y attR, respectivamente), así como las regiones alrededor del sitio de integración del ADN de SCC mee (a saber, attBscc, que es el sitio de integración en el cromosoma bacteriano para el ADN de SCC mee). El sitio attBscc se localizaba en el extremo 3' de un nuevo marco de lectura abierto (ORF, por su nombre en inglés), orfX. El gen orfX posiblemente codifica un polipéptido de 159 aminoácidos que comparte identidad con algunos polipéptidos identificados previamente, pero de función desconocida (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1449-1458). Recientemente, Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152) y Oliveira et al., (Oliveira et al., 2001, Microb. Drug Resist. 7: 349-360) han descrito un nuevo tipo de SCC mee (tipo IV). Las secuencias del extremo derecho del nuevo SCC mee de tipo IV de las cepas de S. aureus CA05 y 8/6-3P publicadas por Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152) eran casi idénticas a lo largo de 2000 nucleótidos al SCC mee de tipo II de la cepa de S. aureus N315 (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents. Chemother,. 45: 1323-1336). No se dispone de secuencias del extremo derecho del SCC mee de

tipo IV en las cepas de S. aureus HDE288 y PL72 descritas por Oliveira et al., (Oliveira et al., 2001, Microb. Drug Resist. 7: 349-360).

Los métodos que se ha usado antes para detectar e Identificar los SARM (Saito et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 2498-2500; Ubukata et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30: 1728-1733; Murakami et al., 1991, J. Clin. Microbiol. 29: 2240-2244; Hiramatsu et al., 1992, Microbiol. Immunol. 36: 445-453), que se basan en la detección del gen mecA y de secuencias cromosómicas específicas de S. aureus, encontraron dificultades a la hora de discriminar entre los SARM y los estafilococos sin coagulasa (SCN) resistentes a la meticilina porque el gen mecA está ampliamente distribuido tanto en S. aureus con en los SCN (Suzuki et al., 1992, Antimicrob. Agents. Chemother. 36: 429-434). Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.° 6 156 507) han descrito un ensayo de PCR específico de los SARM que utiliza cebadores que son capaces de hibridarse específicamente al extremo derecho de los 3 tipos de ADN de SCCmee en combinación con un cebador específico para el cromosoma de S. aureus, que corresponde a la secuencia nucleotídica a la derecha del sitio de integración de SCC mee. Dado que las secuencias nucleotídicas que rodean el sitio de integración de SCC mee en otras especies estafilocócicas (tales como S. epidermidis y S. haemolyticus) son diferentes a las encontradas en S. aureus, este ensayo de PCR era específico para la detectar los SARM. Este ensayo de PCR también suministró información para la tipificación de MREP (por su nombre en inglés, que significa «polimorfismo del extremo derecho de mee») del ADN de SCC mee (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2: 117-129). Este método de tipificación se aprovecha del polimorfismo del extremo derecho de los ADN de SCC mee adyacentes al sitio de integración entre los tres tipos de SCC mee. El tipo III tiene una secuencia nucleotídica única, mientras que el tipo II tiene una inserción de 102 nucleótidos en el extremo derecho del SCC mee de tipo I. El método de tipificación de MREP descrito por Hiramatsu et al., (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2: 117-129) define el SCC mee de tipo I como el MREP de tipo i, el SCC mee de tipo II como el MREP de tipo ¡i y el SCC mee de tipo III como el MREP de tipo iii. Se debe observar que el método de tipificación de MREP no consigue diferenciar entre el SCC mee de tipo II y el nuevo SCC mee de tipo IV descrito por Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents. Chemother. 46: 1147-1152) porque... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) con MREJ de tipos i, ii, iii y v, que comprende:

a) poner en contacto una muestra en la que hay que analizar la presencia de dichas cepas de SARM con MREJ de tipo i, ii, iii y v, en donde dichas cepas de SARM incluyen un elemento del casete cromosómico estafilocócico de mee (SCCmee) que contiene un gen mecA insertado en el ADN cromosómico, mediante lo cual se genera una secuencia de unión en el extremo derecho (MREJ, por su nombre en inglés) polimórfica de tipos i, ii, iii o v que comprende secuencias procedentes tanto del extremo derecho del elemento SCC mee como del ADN cromosómico adjunto al extremo derecho del elemento SCC mee con un primer y un segundo cebador para cada dicho MREJ de tipos i, ii, iii Y v,

en donde dicho primer cebador se híbrida con dicho extremo derecho del elemento SCC mee de una secuencia de MREJ de tipo i, ii, iii o v seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID n.° 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, las SEQ ID n.° 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, las SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y la SEQ ID n.° 47 a 50, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo v; y en donde cada dicho segundo cebador se híbrida con una secuencia cromosómica de S. aureus para generar específicamente uno o varios amplicones si tal cepa de SARM con MREJ de tipo i, ii, iii o v está presente en dicha muestra; y

b) detectar la presencia de dicho uno o varios amplicones.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia cromosómica de S. aureus es orfX.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho método comprende el uso de al menos un cebadory/o sonda seleccionado de las siguientes SEQ ID n.°: 65, 80, 154, 155, 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163 y 164, para la detección de MREJ de tipo v.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende el uso de una pareja de cebadores que consiste en las SEQ ID n.° 64 y 80.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que además comprende el uso de al menos una sonda que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.° 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163 y 164.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dichos cebadores y sondas tienen las siguientes secuencias nucleotídicas: SEQ ID n.° 64, 80, 84, 163 y 164 para detectar los MREJ de tipo v.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se usan juntos muchos cebadores y/o sondas en el mismo confinamiento físico.

8: Un kit para detectar la presencia de cepas de SARM con MREJ de tipos i, ii, iii y v en una muestra, que

comprende:

a) un primer conjunto de oligonucleótidos que se hibridan con el extremo derecho del elemento SCC mee de las secuencias de MREJ de tipos i, ii, iii y v seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.° 1,20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, las SEQ ID n.°2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, las SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y la SEQ ID n.° 47 a 50, y el complemento de la misma, para la MREJ de tipo v; y

b) un segundo oligonucleótido que se híbrida con una secuencia cromosómica de S. aureus;

en donde dichos oligonucleótidos de a) y b) permiten la generación selectiva de uno o varios amplicones que comprende(n) secuencias tanto del extremo derecho del elemento SCC mee como del ADN cromosómico adjunto a dicho extremo derecho de dichas cepas de SARM con MREJ de tipos i, ii, iii y v.

9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha secuencicia específica del ADN cromosómico de S. aureus es orfX.

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde dicho segundo oligonucleótido en b) comprende una secuencia seleccionda del grupo que consiste en las SEQ ID n.° 32, 59, 60 a 64, 70 a 76, 83, 84, 103, 126 a 132, 160 a 164, 200 y 201.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende una pareja de oligonucleótidos que consiste en las SEQ ID n.° 64 y 80.

12. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que además comprende al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.° 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163 y 164.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicho segundo cebador tiene una secuencia como la presentada en la SEQ ID n.° 64.

14. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que comprende cebadores y sondas que 5 tienen las secuencias como las presentadas en las SEQ ID n.° 64, 115, 116, 84, 163 y 164.