Secuencia de adn y preparación recombinante de alérgenos mayores del grupo 4 de cereales.
Molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de un alérgeno mayor del polen de cereales,
seleccionada de una de las secuencias según SEQ ID NO 7 y 9.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10009678.
Solicitante: MERCK PATENT GMBH.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: FRANKFURTER STRASSE 250 64293 DARMSTADT ALEMANIA.
Inventor/es: CROMWELL, OLIVER, NANDY,ANDREAS, FIEBIG,HELMUT PROF.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K31/7088 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Compuestos que tienen al menos tres nucleósidos o nucleótidos.
- A61K38/11
- A61K38/56 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de plantas.
- A61K39/36 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › del polen.
- C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
- C12N15/29 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas vegetales, p. ej. taumatina.
PDF original: ES-2443302_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Secuencia de adn y preparación recombinante de alérgenos mayores del grupo 4 de cereales
Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a la preparación de secuencias de ADN de alérgenos mayores del grupo 4 de cereales (Triticeae) . La invención incluye también fragmentos, combinaciones nuevas de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico. Las moléculas de ADN recombinante y los polipéptidos derivados, fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y variantes se pueden utilizar para la terapia de enfermedades de alergia al polen. Las proteínas recombinantes preparadas se pueden emplear para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.
Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos) , que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas, entre otros, alérgenos del polen de cereales (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001) . Entre los alérgenos del polen de cereales tienen una especial importancia los alérgenos del centeno.
Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas estos alérgenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.
Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.
Los alérgenos del polen de diferentes especies de la familia de las gramíneas (Poaceae) se clasifican en grupos 25 que son homólogos entre sí.
En particular las moléculas del grupo 4 de alérgenos mayores presentan entre sí una alta reactividad inmunológica cruzada, tanto con anticuerpos monoclonales de ratón como con anticuerpos IgE humanos (Fahlbusch y col., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic y col.,
2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6) :361-367; Stumvoll y col. 2002, Biol. Chem. 383:1383-1396; Grote y col., 2002, Biol. Chem. 383:1441-1445; Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1) :43-51) .
Hasta ahora no se conoce una secuencia de ADN completa de ningún alérgeno mayor del grupo 4.
De los alérgenos del grupo 4 de Dactylus glomerata hasta ahora solamente se han obtenido por degradación 35 enzimática y se han secuenciado los péptidos:
DIYNYMEPYVSK (SEQ ID NO 13) ,
VDPTDYFGNEQ (SEQ ID NO 14) ,
ARTAWVDSGAQLGELSY (SEQ ID NO 15) ,
y GVLFNIQYVNYWFAP (SEQ ID NO 16, Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072) .
También se han obtenido por proteolisis y se han secuenciado péptidos de los alérgenos del grupo 4 de la gramínea subtropical Bermuda (Cynodon dactylon) :
KTVKPLYIITP (SEQ ID NO 17) ,
KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (SEQ ID NO 18) ,
TVKPLYIITPITAAMI (SEQ ID NO 19) ,
LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (SEQ ID NO 20) , KWQTVAPALPDPNM (SEQ ID NO 21) , VTWIESVPYIPMGDK (SEQ ID NO 22) , GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (SEQ ID NO 23) ,
TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (SEQ ID NO 24) , YRDLDLGVNQVVG (SEQ ID NO 25) , SATPPTHRSGVLFNI (SEQ ID NO 26) , y AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (SEQ ID NO 27, Liaw y col., 2001, Biochem. Biophys.
Research Communication 280: 738-743) . 10 Para Lolium perenne se describieron fragmentos de péptidos de alérgenos básicos del grupo 4 con las secuencias siguientes: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 28) y GLIEFPAGV (SEQ ID NO 29, Jaggi y col., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348) . Como primera secuencia de un alérgeno del grupo 4 se ha resuelto por parte del inventor de la presente solicitud de patente la secuencia aún no publicada de Phl p 4 de Phleum pratense (SEQ ID NO 11) y se describe en la solicitud 15 internacional WO 04/000881.
Hasta ahora no se sabe nada sobre las secuencias de los alérgenos mayores de grupo 4 de los cereales (Triceae) . Por consiguiente, el objeto en el que se basa la presente invención consiste en la preparación de secuencias de ADN de alérgenos mayores del grupo 4 de los cereales, en particular del alérgeno Sec c 4 de centeno (Secale cerale) (SEQ ID NO 1, 3) , Hor v 4 de cebada (Hordeum vulgare) (SEQ ID NO 5) y Tri a 4 de trigo (Triticum aestivum)
(SEQ ID NO 7, 9) , así como de las correspondientes moléculas de ADN recombinante sobre cuya base se pueden expresar los alérgenos como proteína y se puede hacer accesible un aprovechamiento significativo como tal o en forma modificada. La secuencia de Phl p 4 (SEQ ID NO 11) ha sido el punto de partida para la presente invención.
Índice de secuencias según la invención A las secuencias de ADN y proteínas de los alérgenos maduros según SEQ ID NO 1-10 las precede una secuencia 25 señal. Con los codones de parada TGA o TAG en la secuencia de ADN termina el segmento codificante.
- Secuencia de ADN de Sec c 4. (a) Isoforma Sec c 4.01 (SEQ ID NO 1) , (b) Isoforma Sec c 4.02 (SEQ ID NO 3) .
- Secuencias de proteína (SEQ ID NO 2, 4) derivadas de las secuencias de ADN según SEQ ID NO 1 y 3.
- Secuencia de ADN de Hor v 4 (SEQ ID NO 5) .
- Secuencia de proteína (SEQ ID NO 6) derivada de la secuencia de ADN según SEQ ID NO 5. 30 - Secuencia de ADN de Tri a 4. (a) Isoforma Tri a 4.01 (SEQ ID NO 7) , (b) Isoforma Tri a 4.02 (SEQ ID NO 9) .
- Secuencias de proteína (SEQ ID NO 8, 10) derivadas de las secuencias de ADN según SEQ ID NO 7 y 9.
- Secuencia de ADN de Phl p 4 (SEQ ID NO 11) según SEQ ID NO 5 del documento WO 04/000881.
- Secuencia de proteína de Phl p 4 (SEQ ID NO 12) según SEQ ID NO 6 del documento WO 04/000881.
Descripción de la invención Con la presente invención se proporcionan ahora por primera vez las secuencias de ADN del alérgeno mayor del polen de cereales Sec c 4, Hor v 4 y Tri a 4 según SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, y 9.
Por consiguiente, son objeto de la presente invención las moléculas de ADN seleccionadas a partir de las secuencias de nucleótidos según SEQ ID NO 7 y 9.
Por consiguiente, la invención también trata de secuencias homólogas a la secuencia de ADN según la invención o moléculas de ADN correspondientes de los alérgenos del grupo 4 de otras Poaceae, como por ejemplo Lolium
perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon y Holcus lanatus, que hibridan bajo condiciones rigurosas a causa de la homología existente en las secuencias con el ADN según la invención, o presentan una reactividad inmunológica cruzada respecto los alérgenos según la invención.
La invención incluye también fragmentos, combinaciones nuevas de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico.
Por consiguiente, también son objeto de la invención las correspondientes secuencias parciales, una combinación de secuencias parciales o mutaciones de intercambio, eliminación o adición, los cuales codifican para un fragmento inmunomodulador y reactivo frente a células T de un alérgeno del grupo 4 de Poaceae.
Con el conocimiento de la secuencia de ADN de los alérgenos que existen en la naturaleza ahora sólo es posible preparar estos alérgenos como proteínas recombinantes, que se pueden emplear en el diagnóstico y la terapia de enfermedades alérgicas (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391) .
La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6) : 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4) : 558-562) . Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes. No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de un alérgeno mayor del polen de cereales, seleccionada de una de las secuencias según SEQ ID NO 7 y 9.
2. Vector de expresión de ADN recombinante o un sistema de clonación que contiene una molécula de ADN 5 según la reivindicación 1, unido funcionalmente con una secuencia control de expresión.
3. Procedimiento para la preparación de un polipéptido, codificado mediante una secuencia de ADN según la reivindicación 1, mediante cultivo de un organismo huésped y obtención del correspondiente polipéptido a partir del cultivo.
4. Polipéptido que comprende una de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO 8 y 10, el cual codifica 10 para una secuencia de ADN según la reivindicación 1.
5. Polipéptido que comprende el alérgeno maduro de las secuencias de aminoácidos según la reivindicación 4, seleccionado del siguiente grupo de secuencias de aminoácidos
- una de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO 8 o 10.
6. Polipéptido según la reivindicación 4 o 5 como medicamento.
8. Uso de al menos un polipéptido según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.
10. Vector de expresión recombinante según la reivindicación 7 como medicamento.
11. Preparación farmacéutica que contiene al menos una molécula de ADN según la reivindicación 9 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 10 para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de
dichas alergias.
12. Uso de al menos una molécula de ADN según la reivindicación 9 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 10 para la preparación de un medicamento para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.
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