Una molécula de ADN correspondiente a una secuencia de nucleótidos, seleccionada de un grupo consistente en SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 5.

Secuencia de ADN y preparación recombinante del alérgeno del polen de gramíneas PHI P 4.

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a la preparación de la secuencia genética del alérgeno principal del polen de gramíneas PhI p 4. La invención también incluye fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico. Las moléculas de ADN recombinante y los polipéptidos derivados, fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y variantes se pueden utilizar para la terapia de enfermedades de alergia al polen. Las proteínas recombinantes preparadas se pueden emplear para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos) , que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001) .

Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción a través de las mucosas estos alérgenos reaccionan con las moléculas IgE que están unidas a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.

Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.

En el caso de la hierba timotea (Phleum pratense) hasta el momento se han identificado como alérgenos principales Phl p 1 (Petersen y col., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796) , Phl p 5 (Matthiesen y Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109) , Phl p 6 (Petersen y col., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) . Phl p 2/3 (Dolecek y col., 1993, FEBS 335 (3) , 299-304) , Phl p 4 (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) y PhI p 13 (Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402) .

Phl p 4 se ha descrito como una glicoproteína básica con una masa molecular de entre 50 y 60 kDa (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268) . La molécula de Phl p 4 es resistente a la tripsina (Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) y un 70-88 % de los alérgicos al polen de gramíneas presentan anticuerpos IgE contra esta molécula (Valenta y col., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi y col., 2001, Allergy 56:1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33:43-51) . Se han descrito moléculas homólogas a partir de especies de gramíneas relacionadas (Su y col., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi y col., 1989, Int. Arch.

Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi y col., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14 - 17) . Estas moléculas homólogas de Poaceae forman el grupo 4 de alérgenos, cuyas moléculas presentan entre sí una alta reactividad inmunológica cruzada, tanto con anticuerpos monoclonales de ratón como con anticuerpos IgE humanos (Fahlbusch y col., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrović-Jankulović y col., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6) : 361-367; Stumvoll y col. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote y col., 2002, Biol. Chem. 383: 1441-1445; Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1) : 43-51) .

A diferencia de los alérgenos principales previamente mencionados de Phleum pratense (Phl p 1, Phl p 2/3, Phl 5a y 5b, Phl p 6 y Phl p 13) la estructura primaria del PhI p 4 todavía no se ha resuelto. Igualmente, no existe ninguna secuencia completa de moléculas del grupo 4 de otras especies de gramíneas.

La determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal no ha tenido éxito hasta el momento. Sin embargo, no se sabe cuales son las causas. Fischer y col. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) suponen un bloqueo Nterminal, pero pudieron purificar un péptido interno tras la degradación con lisil-endopeptidasa y determinar la secuencia del mismo: IVALPXGMLK (SEC ID Nº 7) .

Este péptido presenta homologías con las secuencias peptídicas de los alérgenos de ambrosias Amb a1 y Amb a2, así como semejanzas con las secuencias de proteínas de maíz (Zm58.2) , tomate (lat 59, lat 56) y tabaco (G10) (Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) . Para Lolium perenne se describieron fragmentos de péptidos de alérgenos básicos del grupo 4 con la secuencia siguiente: FLEPVLGLIFPAGV (SEC ID Nº 8) y GLIEFPAGV (SEC ID Nº 9) (Jaggi y col., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348) .

De los alérgenos del grupo 4 de Dactylus glomerata hasta ahora solamente se han obtenido por degradación enzimática y se han secuenciado los péptidos: DIYNYMEPYVSK (P15, SEC ID Nº 10) , VDPTDYFGNEQ (P17, SEC ID Nº 11) , ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEC ID Nº 12) , y GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEC ID Nº 13) (Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072) . También se han obtenido por proteólisis y se han secuenciado péptidos de los alérgenos del grupo 4 de la gramínea subtropical Bermuda (Cynodon dactylon) :

KTVKPLYIITP (S, SEC ID Nº 14) , KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEC ID Nº 15) , TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEC ID Nº 16) , LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEC ID Nº 17) , KWQTVAPALPDPNM (P2, SEC ID Nº 18) , VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEC ID Nº 19) , GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEC ID Nº 20) , TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEC ID Nº 21) , YRDLDLGVNQVVG (P3, SEC ID Nº 22) , SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEC ID Nº 23) , y AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEC ID Nº 24) (Liaw y col., 2001, Biochem. Biophys.

Research Communication 280: 738-743) .

Sin embargo, estas secuencias peptídicas descritas para PhI p 4 y otros alérgenos del grupo 4 no han conducido hasta ahora a la resolución completa de la estructura primaria de los alérgenos del grupo 4. Por lo tanto, el objeto en el que se basa la presente invención consta de la preparación de la secuencia de ADN

completa del PhI p 4, así como de un ADN recombinante correspondiente sobre cuya base se pueda expresar el alérgeno PhI p 4 como proteína y se pueda hacer accesible un aprovechamiento farmacológico significativo como tal o en forma modificada.

Índice de figuras Figura 1: Secuencia de ADN interna (SEC ID Nº 25) del gen de PhI p 4 Con los cebadores degenerados Nº 30 (sentido) y Nº 37 (antisentido) , ambos representados en cursiva, se clonaron y secuenciaron productos de amplificación obtenidos con ADN genómico. La secuencia presentada representa el consenso de 6 clones. El cebador sentido Nº 82 específico creado a partir de esta secuencia se presenta subrayado.

Figura 2: Extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID Nº 26) del gen de PhI p 4 En una PCR RACE 3' con ADNc de Phleum pratense se obtuvieron y secuenciaron productos de amplificación con el cebador sentido Nº 82 específico (en cursiva) así como un cebador de anclaje. La secuencia presentada representa el consenso de 3 secuenciaciones y comprende el extremo 3' del gen de PhI p 4 hasta el codón de parada (doblemente subrayado) . Los fragmentos de la secuencia que se han preparado para la construcción de los cebadores antisentido Nº 85 y Nº 86 están subrayados.

Figura 3: Localización del péptido de PhI p 4 en la secuencia de aminoácidos deducida del alérgeno PhI p 4 (SEC ID Nº 2)

Los péptidos P1 - P6 (SEC ID Nº 27-32) obtenidos a partir de la secuenciación de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN correspondiente a una secuencia de nucleótidos, seleccionada de un grupo consistente en SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 5.

2. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y empieza con la posición 70, la cual codifica para un polipéptido con las características del alérgeno mayor PhI p 4 de Phleum pratense.

3. Una molécula de ADN con una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 que empieza con la posición 70, la cual codifica para un polipéptido con las características del alérgeno mayor PhI p 4 de

Phleum pratense.

4. Una molécula de ADN que hibrida con una molécula de ADN según la reivindicación 1 o 2 bajo condiciones rigurosas y deriva de secuencias de ADN de la especie Poaceae.

5. Una molécula de ADN, que codifica para un polipéptido, que se caracteriza porque el polipéptido se selecciona del grupo consistente en

- un polipéptido con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6.

- un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 con divergencias en los aminoácidos según los clones del 1 al 11:

- Clon 1 L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472,

- Clon 2: L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472,

- Clon 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351,

- Clon 4: G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472,

- Clon 5: L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472,

- Clon 6: N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460,

- Clon 7: K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384,

- Clon 8: Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, E351,

- Clon 9: M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334,

- Clon 10: Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, inserción de GA entre las posiciones 407 y 408, N452, Y456, A457, K460, E472,

- Clon 11: Inserción de GA entre las posiciones 407 y 408.

6. Una molécula de ADN, correspondiente a una secuencia parcial o una combinación de secuencias parciales según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 5, la cual codifica para un fragmento de PhI p 4 inmunomodulador y reactivo frente a células T, seleccionado del grupo consistente en

- fragmento 1-200, con los aminoácidos 1-200 del PhI p 4 y

- fragment.

18. 500, con los aminoácido.

18. 500 del PhI p 4.

7. Una molécula de ADN, correspondiente a una secuencia de nucleótidos según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 6, que codifica para un fragmento inmunomodulador y reactivo frente a células T, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos se modificó de forma dirigida mediante un intercambio dirigido de una, varias o todas las cisteínas del polipéptido frente a otro aminoácido.

8. Un vector de expresión de ADN recombinante que contiene una molécula de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 7, unido funcionalmente con una secuencia control de

expresión.

9. Un organismo huésped, transformado con una molécula de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 7 o un vector de expresión según la reivindicación 8.

10. Un polipéptido preparado de forma recombinante, el cual es codificado por una secuencia de ADN según una o varias de las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 6, y 7.

Fig. 1 Secuencia de ADN interna del gen de PhI p 4

Fig. 2 Extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos del gen de PhI p 4

Fig. 3 Localización de los péptidos de PhI p 4 en la secuencia de aminoácidos deducida del alérgeno PhI p 4

Fig. 4 Determinación de la identidad del PhI p 4 recombinante (rPhI p 4) mediante los anticuerpos monoclonales específicos 5H1 (transferencia A) y 3C4 (transferencia B) por transferencia Western

Fig. 5 Determinación de la reactividad del PhI p 4 recombinante (rPhI p 4) con IgE de sueros de alérgicos al polen de gramíneas por transferencia Western