SE DESCRIBE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CONTIENE UNA SECUENCIA QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE MEDIA EN LA CAPTACION DE L ACIDO NUCLEICO.

LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO SE UTILIZAN PARA TRANSFORMAR CELULAS PARA SU UTILIZACION EN LA MEDIACION DE LA CAPTACION DE MALATO, DE ACIDO SUCCINICO O DE MALONATO, EN PARTICULAR DE LA CAPTACION DE MALATO DURANTE LA FERMENTACION DE VINOS

Secuencia de ácido nucleico para una malato permeasa de S. pombe y sus usos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento y a una secuencia de nucleótidos para la transformación de microorganismos. Más particularmente, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante, a un gen, a un polipéptido, a una cepa de levadura transformada, a un procedimiento de transformación de una cepa de levadura, a un procedimiento de producción de un polipéptido deseado, y a un procedimiento de fermentación.

Antecedentes de la invención

El transporte de ácido L-málico a través de la membrana plasmática y su degradación en microorganismos es de interés considerable en muchos campos, particularmente aquellos que implican la fermentación por levaduras. El ácido L-málico puede ser usado como única fuente de carbono y energía por las levaduras Candida sphaerica (Corte-Real y col-, 1989), Hansenula anomala (Corte-Real y Leao, 1990) y Candida utilis (Cassio y Leao, 1993). La forma disociada del malato es transportada a través de la membrana plasmática por simportes protónicos que son inducibles y están sometidos a la represión de la glucosa. No obstante, en Zygosaccharaomyces bailii (Rodríguez y Thornton, 1990) y Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) (Sousa y col., 1992), el ácido L-málico sólo se puede metabolizar en presencia de una fuente de carbono asimilable (Osothsilp y Subden, 1986). El ácido málico es transportado de manera activa en la forma disociada mientras que el ácido no disociado entra en la célula por difusión simple (Baranowski y Radler, 1984; Osothsilp y Subden, 1986; Sousa y col., 1992). La inhibición competitiva de las velocidades de captación inicial del ácido L-málico por el ácido succinico, el ácido D-málico, ácido fumárico, ácido oxaloacético, ácido a-cetoglutárico, ácido maleico y ácido malónico sugiere fuertemente que estos ácidos son transportados por el mismo transportador en S. pombe (Sousa y col., 1992).

La degradación del ácido mélico es de interés particular para las bodegas. Las cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) del vino no pueden metabolizar eficazmente el malato en el mosto de la uva y los cambios en la acidez total del vino durante la vinificación son, por tanto, insignificantes (Gao, 1995). La producción de vinos equilibrados requiere la reducción controlada del ácido málico en exceso, particularmente en las regiones viticultoras del mundo más frías.

Se ha usado la desacidificación química para reducir la acidez total del vino. La desacidificación química normalmente se lleva a cabo mediante (a) mejora - que esencialmente es la dilución del ácido málico con agua azucarada; (b) precipitación - la adición de calcio, potasio u otros cationes para producir una sal insoluble; o (c) enmascaramiento - la adición de zumo de uva o sacarosa al vino finalizado para enmascarar el sabor agrio del ácido málico. Todos estos procedimientos dan como resultado malato residual que puede ayudar a la fermentación maloláctica por bacterias contaminantes, a menos que se trate con dosis elevadas de sulfitos.

Los procedimientos de fermentación maloláctica para la degradación del ácido málico dependen de la conversión del ácido L-málico en ácido L-láctico y CO₂ por bacterias malolácticas, por ejemplo, especies de Leuconostoc, Lactobacillus, y Pediococcus. Las bacterias malolácticas pueden encontrarse sobre las uvas que se convierten en parte de la microflora del lagar, o se pueden introducir en el vino cultivos congelados o crio-desecados disponibles comercialmente de las bacterias. Los procedimientos de fermentación malolácticos presentan una serie de desventajas; por ejemplo, las bacterias malolácticas fermentan los terpenos que cambian el carácter del vino. El control de las fermentaciones malolácticas a menudo es difícil, que da como resultado una fermentación maloláctica incompleta y fermentaciones posteriores en botella. Normalmente el crecimiento bacteriano también está acompañado por la producción de dióxido de carbono que puede dar como resultado un vino "gaseoso".

También se han usado cepas de levadura que pueden degradar el ácido L-málico en fermentaciones del vino. Se han intentado fermentaciones que usan la levadura de fisión S. pombe que degrada completamente el malato en etanol mediante una fermentación malo-etanólica. Thornton (patente de EE.UU. Nº 4.830.968) describe un procedimiento que supone la inoculación de zumo de uva con una cepa de Saccharomyces malidevorans que es capaz de degradar parcialmente el ácido L-málico en condiciones de elaboración del vino. No obstante, estas cepas de levaduras (es decir, Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces malidevorans) no son deseables en la preparación del vino, puesto que se producen sabores desagradables. También se han usado suspensiones celulares de alta densidad de diversas levaduras, incluyendo S. cerevisiae, para intentar incrementar la velocidad a la que se degrada el L-malato durante la fermentación (Gao, 1995).

Se han llevado a cabo intentos para hibridar levaduras del vino con cepas de levaduras que metabolizan el malato. La fusión de protoplastos (Carrau y col., 1982; Svoboda, 1980, patente de EE.UU. Nº 5.330.774 de Carrau y col.), la transformación (Lautensach y Subden, 1984; Williams y col., 1984), y otros medios (Fernandez, 1967; Goto y col., 1978; Kuczynski y Radler, 1982) no han tenido éxito.

Se ha explorado el tratamiento por ingeniería metabólica de cepas de S. cerevisiae para llevar a cabo simultáneamente la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica o malo-etanólica. El gen maloláctico (mleS) de Lactobacillus delbrueckii (Williams y col., 1984) y Lactococcus lactis (Ansanay y col., 1993, Denayrolles y col., 1994) ha sido clonado, caracterizado y se han realizado varios intentos para introducir y expresar este gen en S. cerevisiae. No obstante, las cepas recombinantes de S. cerevisiae que expresan el gen mleS eran incapaces de degradar eficazmente el malato a L-lactato (Williams y col., 1984; Ansanay y col., 1993, Denayrolles y col., 1995).

J.C. van Slooten y col. describen en MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS 1992, 5, 179-186 una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida de un gen dctA de una especie de Rhizobium. Se considera que el gen dctA codifica un gen de la proteína transportadora dctA que está involucrada en el sistema de transporte del dicarboxilato; resultó ser un análogo u homólogo de una malato permeasa eucariota.

C. Buser-Suter y col. describen en PLANT PHYSIOL: (1982) 69, 456-459 la presencia de una ácido málico permeasa en vacuolas de plantas aisladas de Bryophyllum daigremonitianum.

MJ Sousa y col. examinan en YEAST 1992, 8, 1025-1031 el transporte de ácido málico en S. pombe y describen la evidencia de un simporte protón-dicarboxilato.

Viljoen M. y col. describen en YEAST 1994, 10, 613-624 un análisis molecular del gen de la enzima málica (mae2) de S. pombe.

Osothsilp C. y col. describen en JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1986, 168, 1439-1443 el transporte de malato en S. pombe.

Roson CW y col. describen en JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1984, 160, 903-909 la clonación molecular y la organización genética de genes transportadores dct de Rhizobium.

Ortiz y col. enseñan en EMBO JOURNAL 1992, 11, 3491-34 99 que la tolerancia a metales pesados en levaduras de fisión requiere un transportador de membrana vacuolar de tipo cassette de unión a ATP y describen la complementación de la clonación de un transportador de membrana vacuolar procedente de S. pombe.

Así, era un objeto proporcionar una molécula de ácidos nucleicos que codificase una proteína que medie en la captación de L-malato, succinato, y malonato en eucariotas.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han identificado un gen en S. pombe, designado gen mae1 o gen de la malato permeasa, que codifica una permeasa de un ácido dicarboxílico (denominada en el presente documento como "malato permeasa" o "Mae1"). Esta es la primera caracterización molecular de una permeasa de un ácido dicarboxílico en una célula eucariota. El gen mae1 de S. pombe codifica un único ARNm de 1,5 kb. El gen se expresa constitutivamente y no está sometido a represión catabólica...

1. Una molécula de ácidos nucleicos aislada, que comprende

(i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3;

(ii) secuencias de ácidos nucleicos complementarias a (i);

(iii) secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico de (i),

que codifica una malato permeasa eucariota de S. pombe que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato.

2. Una molécula de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 1 en la que la proteína contiene una región PEST, y un motivo de cremallera de leucinas.

3. Una molécula de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 1 que comprende

(i) una secuencia de ácidos nucleicos según la SEQ ID NO: 1 o la Figura 3, en la que la T también puede ser U;

(ii) secuencias de ácidos nucleicos complementarias a (i), preferentemente complementarias a la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3;

(iii) una secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico de (i), o

(iv) una secuencia de ácidos nucleicos que difiere de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) en las secuencias del codón debido a la degeneración del código genético.

4. Una sonda de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 1, que codifica al menos 6 ácidos nucleicos secuenciales a partir de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3.

5. Un procedimiento de aislamiento de un ácido nucleico según la reivindicación 1 que comprende la puesta en contacto de un ácido nucleico que contiene la muestra con una sonda según la reivindicación 4 en condiciones que permiten la hibridación de la sonda con una molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, si está presente en la muestra, y el aislamiento de la molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión recombinante adaptado para la transformación de una célula hospedadora que comprende una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Una célula hospedadora eucariota transformada con un vector de expresión recombinante según la reivindicación 6.

8. Una célula hospedadora eucariota según la reivindicación 7, dicha célula que tiene integrado en su genoma dicha molécula de ácidos nucleicos.

9. Una célula hospedadora eucariota que tiene integrado en su genoma una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima maloláctica.

10. Una célula hospedadora eucariota que tiene integrado en su genoma una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima málica.

11. Una célula eucariota transformada con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima maloláctica.

12. Una célula eucariota transformada con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima málica.

13. Una célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en la que la célula degrada el L-malato durante la fermentación alcohólica.

14. Una célula de Saccharomyces según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en la que la célula degrada el L-malato durante la fermentación alcohólica del vino.

15. Una célula de levadura según la reivindicación 9 u 11, en la que la célula es útil en la degradación del L-malato a L-lactato y CO₂ durante la fermentación alcohólica.

16. Una célula de levadura según la reivindicación 10 ó 12, en la que la célula es útil en la degradación del L-malato a etanol y CO₂ durante la fermentación alcohólica.

17. Una célula eucariota según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 que es una célula de levadura.

18. Una célula eucariota según una cualquiera de las reivindicaciones 7 al 17 que es Saccharomyces.

19. Una célula eucariota según la reivindicación 18 que es S. cerevisiae o S. bayanus.

20. Un procedimiento de incremento de la captación de L-malato, ácido succinico o malonato en una célula que comprende la transformación de la célula con una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

21. Un procedimiento para dotar a un microorganismo de la capacidad de degradar el malato que comprende la transformación del microorganismo con una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

22. Un procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que el microorganismo es una cepa de levadura.

23. Un procedimiento de degradación del malato, que comprende el cultivo, en presencia de malato, de un microorganismo que ha sido transformado con una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

24. Un procedimiento de degradación del malato que comprende el cultivo, en presencia de malato, de una célula transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 7 al 19.

25. Un procedimiento de degradación del malato durante la fermentación del vino, cuyo procedimiento comprende el cultivo, en mostos de uva que contienen malato, de una cepa de levadura según la reivindicación 17, 18 ó 19.

26. Un procedimiento de fermentación del vino, que incluye el cultivo, en un medio de fermentación del vino que incluye un mosto de uva que contiene malato, de una cepa de levadura según la reivindicación 17, 18 ó 19.

27. Un procedimiento según la reivindicación 22, 25 ó 26, en el que la cepa de levadura es una cepa de Saccharomyces.

28. Un procedimiento para la preparación de una proteína que media en la captación de L-malato, succinato y malonato, que comprende (a) la transferencia de un vector de expresión recombinante según la reivindicación 6 a una célula hospedadora; (b) la selección de las células hospedadoras transformadas entre las células hospedadoras no transformadas; (c) el cultivo de una célula hospedadora transformada seleccionada en condiciones que permiten la expresión de la proteína; y (d) el aislamiento de la proteína.

29. Una proteína aislada caracterizada porque está codificada por una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

30. Una proteína aislada según la reivindicación 29, caracterizada porque tiene parte o toda la conformación estructural primaria y la actividad enzimática de la malato permeasa de S. pombe.

31. Una proteína aislada según la reivindicación 30, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3.

32. Una proteína aislada según la reivindicación 29, 30 ó 31, que es un truncamiento de la proteína o una isoforma de la proteína y sus truncamientos, que tiene actividad malato permeasa.

33. Anticuerpos que tienen actividad específica contra un epítopo de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

34. Un procedimiento para la detección de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, que comprende la puesta en contacto de una muestra con un anticuerpo según la reivindicación 33.

35. Un procedimiento para la identificación de una sustancia que media en el transporte del L-malato, succinato o malonato que comprende la incubación de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 con un sustrato de la proteína, y una sustancia de prueba que se sospecha que afecta a la actividad de la proteína, y la determinación del efecto de la sustancia comparándola con un control.