SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSFORMADA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA PROTEÍNA LK8 UTILIZANDO LA MISMA.

Cepa de Saccharomyces cerevisiae transformada, que es Saccharomyces cerevisiae BJ3501/MδLK836 depositada con el nº de orden: KCTC10582BP

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/KR2005/000214.

Solicitante: MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE.

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 341 BOJUNG-RI, GOOSUNG-EUP YONGIN CITY GYUNGGI-DO 449-910 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: PARK,JUNG HWAN, LIM,Hyung-Kwon, KIM,Sung-Geun.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 26 de Enero de 2005.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/755 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factores VIII.
  • C12N15/81 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para levaduras.

Clasificación PCT:

  • C07K14/755 C07K 14/00 […] › Factores VIII.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N15/81 C12N 15/00 […] › para levaduras.

Clasificación antigua:

  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania.

PDF original: ES-2356641_T3.pdf

 

Ilustración 1 de SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSFORMADA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA PROTEÍNA LK8 UTILIZANDO LA MISMA.
Ilustración 2 de SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSFORMADA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA PROTEÍNA LK8 UTILIZANDO LA MISMA.
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Ilustración 4 de SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSFORMADA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA PROTEÍNA LK8 UTILIZANDO LA MISMA.
Ilustración 5 de SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSFORMADA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA PROTEÍNA LK8 UTILIZANDO LA MISMA.
SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSFORMADA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA PROTEÍNA LK8 UTILIZANDO LA MISMA.

Fragmento de la descripción:

Sector técnico

La presente invención hace referencia a un método para preparar proteína LK8, más particularmente, a un método para la producción en masa de proteína LK8 utilizando Saccharomyces cerevisiae transformada con un gen que codifica la proteína LK8 que posee actividad inhibidora de la angiogénesis.

Estado de la técnica

La angiogénesis es un proceso biológico que proporciona nuevos vasos a órganos o tejidos. Particularmente, se generan nuevos capilares sanguíneos a partir de microvasos preexistentes, que están en proceso de crecimiento para transformarse en vasos sanguíneos. La angiogénesis, como proceso fisiológico normal, solamente se observa en situaciones concretas en el cuerpo humano, por ejemplo durante el desarrollo fetal y embrionario, durante la maduración del útero, durante la proliferación de la placenta, durante la formación del cuerpo lúteo y para la curación de heridas. Incluso en estos casos, la angiogénesis está regulada de forma precisa y se detiene una vez ha finalizado su función. La angiogénesis se encuentra regulada de forma estricta por un factor regulador de la angiogénesis (Folkman, J. Nature Med 1: 27-31, 1995) y el fenotipo de angiogénesis parece ser diferente según el equilibrio existente entre el incremento de la expresión de un factor estimulador de la angiogénesis y la disminución de la expresión de un factor inhibidor de la angiogénesis.

Aunque el proceso de angiogénesis es muy complicado y sofisticado, puede describirse del siguiente modo. En primer lugar, se transmite un estímulo para la angiogénesis a un vaso preexistente, dando lugar a la expansión del vaso sanguíneo y al incremento de la permeabilidad de la membrana. En segundo lugar, la fibrina sale del vaso expandido y a continuación se acumula en el citosol alrededor del vaso sanguíneo. En tercer lugar, se activa un enzima para descomponer la membrana basal del vaso preexistente. En cuarto lugar, se destruye la membrana basal de manera que las células endoteliales salen del vaso sanguíneo y proliferan en el citosol existente alrededor y a continuación vuelven a desplazarse. En último lugar, dichas células endoteliales se alinean formando un vaso, dando lugar a un nuevo vaso sanguíneo.

Son ejemplos de enfermedades relacionadas con la angiogénesis las enfermedades inflamatorias incluyendo las artritis, las enfermedades oculares incluyendo la retinopatía diabética, las enfermedades dermatológicas incluyendo la psoriasis y el cáncer que es la enfermedad relacionada con la angiogénesis más representativa de entre todas las enfermedades (Folkman, J., Nature Med., 1:27-31, 1995). En concreto, la angiogénesis es esencial para el crecimiento de los tumores primarios y metastáticos (Folkman, J., New Engl. J. Med., 285:1182-1186, 1971; Folkman, J., J. Biol. Chem., 267:10931-10934, 1992). Ello significa que un tumor no puede crecer cuando se inhibe o detiene la angiogénesis, lo cual indica que la inhibición de la angiogénesis podría ser una forma eficaz de tratamiento a largo plazo de tumores.

Por lo tanto, se requiere de forma urgente el desarrollo de nuevos inhibidores de la angiogénesis para inhibir o detener la misma y además proporcionar dichos inhibidores al usuario a precios moderados resultantes de una producción en masa efectiva de los mismos.

Los inhibidores de la angiogénesis se consideran como uno de los métodos de tratamiento más favorables para el cáncer pues se dirigen a los vasos sanguíneos que suministran nutrientes al tumor, en lugar de atacar directamente las células cancerosas, lo cual supone que se reduce la resistencia contra dichos fármacos. Se ha comprobado la eficacia de diversos inhibidores para inhibir la angiogénesis de tumores, tales como los inhibidores naturales hallados in vivo, los inhibidores integrina, los inhibidores de la señal de transducción y los inhibidores de la proteolisis, y se están ensayando clínicamente (Brower, V., Nat. Biotechnol., 17:963-8, 1999; Carmeliet, P. y Jain, R. K., Nature 407:249-57, 2000). Entre estos inhibidores ensayados clínicamente, es conocido que LK6, LK7 y LK8, que son las subunidades kringle 36a, 37a y 38a de la apolipoproteína humana Apo(a), mencionadas en la publicación de patente internacional WO 01/19868 poseen actividad inhibidora de la angiogénesis conjuntamente con actividades inhibidoras del crecimiento y la migración de las células epiteliales. Especialmente, la proteína LK8 muestra la actividad más elevada. Para proporcionar precios moderados para la producción de la proteína LK8 para examinar los efectos de la proteína, realizar ensayos clínicos y para su utilización comercial, es esencial el desarrollo de un método de producción en masa de proteína LK8 mediante el cultivo de cepas recombinantes transformadas con el gen LK8.

Por lo tanto, los presentes inventores han estudiado las funciones de la proteína LK8 y el método para la utilización comercial efectiva de dicha proteína. En último término, los presentes inventores han preparado Saccharomyces cerevisiae recombinantes transformando la levadura Saccharomyces cerevisiae con un vector plásmido que contiene el gen LK8 o insertando el gen LK8 dentro de un cromosoma huésped, y a continuación han seleccionado las cepas productores en masa de la proteína LK8. Los presentes inventores también han determinado las condiciones óptimas de cultivo para el crecimiento de las cepas y finalmente han completado la presente invención confirmado que puede bajo dichas condiciones puede producirse en masa proteína LK8 de alta calidad.

Descripción de la invención

Problema técnico

Es un objetivo de la presente invención el dar a conocer un método de preparación de una cepa de levadura transformada capaz de producir en masa proteína LK8, un inhibidor de la angiogénesis, y un método para la producción en masa de la proteína LK8 mediante el cultivo de dicha cepa.

Solución técnica

Para conseguir el objetivo citado, en la presente invención se da a conocer el vector de expresión recombinante MLK8 que contiene el casete de expresión de LK8 formado por un promotor, una secuencia de secreción, el ADNc de LK8 representado por el identificador de secuencia nº 1 y un terminador, es este orden.

También se describe una cepa de Saccharomyces cerevisiae transformada preparada transfectando una cepa huésped con dicho vector recombinante.

Adicionalmente se da a conocer un método para la preparación de un transformante con un nivel elevado de expresión de proteína LK8, que comprende las etapas siguientes: (1) transformar una cepa huésped con el vector recombinante previamente mencionado; (2) cultivar el transformante preparado en la etapa 1 tras tratamiento con el antibiótico G418 sulfato; y (3) detectar los transformantes con niveles elevados de expresión de LK8 mediante inmunoensayo.

También se describe un método para la producción en masa de la proteína LK8, que comprende las etapas siguientes: (1) preparar una cepa transformada mediante la inserción del vector de expresión recombinante con el gen LK8, MdLK8, en una cepa huésped, (2) cultivar por siembra la cepa transformada preparada en la etapa 1 y proceder al cultivo discontinuo de la cepa en un medio líquido que contiene glucosa y galactosa como fuente de carbono, manteniendo el oxígeno disuelto estable mediante la regulación del suministro de aire y la velocidad de agitación; (3) proceder al cultivo semicontinuo (“fedbatch”) de la solución de cultivo de la etapa 2 en un medio líquido que contiene galactosa como fuente de carbono; y (4) purificar la proteína LK8 a partir de la solución de cultivo de la etapa 3.

La invención se define mediante las reivindicaciones.

De aquí en adelante, se describe la presente invención de forma detallada.

En la presente invención, se da a conocer el vector de expresión recombinante MLK8 que contiene el casete de expresión de LK8 formado por un promotor, una secuencia de secreción, el ADNc de LK8 representado por el identificador de secuencia nº 1 y un terminador, en este orden, la secuencia  para la inserción múltiple del casete de expresión de LK8 dentro del cromosoma de la cepa huésped, y el gen de resistencia a la neomicina (neo) para la selección tras la inserción múltiple. En una realización preferente del vector de expresión recombinante MLK8 de la presente invención, dicho promotor es el promotor GAL1. En una realización preferente de la presente invención... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Cepa de Saccharomyces cerevisiae transformada, que es Saccharomyces cerevisiae BJ3501/MLK8#36 depositada con el nº de orden: KCTC10582BP.

2. Método para la producción en masa de la proteína LK8 que comprende las etapas de:

(1) Cultivar por siembra la cepa de Saccharomyces cerevisiae transformada según la reivindicación y proceder al cultivo discontinuo de la cepa en un medio líquido que contiene glucosa y galactosa como fuentes de carbono, manteniendo el oxígeno disuelto estable mediante la regulación del suministro de aire y/o la velocidad de agitación;

(2) Proceder al cultivo semicontinuo de la solución de cultivo de la etapa 1 con un medio de alimentación que contiene galactosa; y

(3) Purificar la proteína LK8 de la solución de cultivo de la etapa 2.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que dicho cultivo discontinuo de la etapa 1 se realiza con un suministro de aire entre 1 y 3 vvm (5 – 80 L/minuto) y/o una velocidad de agitación entre 200 y

1.000 rpm, en un medio líquido que contiene entre un 1% y un 5% (peso/volumen) de glucosa y entre un 1% y un 5% (peso/volumen) de galactosa como fuente de carbono, en el cual se ajusta el oxígeno disuelto a entre un 40% y un 90% del oxígeno disuelto máximo.

4. Método, según la reivindicación 2, en el que dicho cultivo semicontinuo de la etapa 2 se realiza utilizando un medio líquido que contiene entre un 10% y un 50% (peso/volumen) de galactosa como fuente de carbono y regulando la velocidad de suministro del medio de alimentación para mantener el contenido de galactosa en el medio entre un 0,5% y un 5% (peso/volumen).

5. Método, según la reivindicación 2, en el que dicha purificación de la proteína LK8 de la etapa 3 se realiza mediante cromatografía.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que dicha cromatografía incluye una cromatografía de intercambio iónico y una cromatografía de interacción hidrofóbica.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que dicha cromatografía de intercambio iónico es una cromatografía de intercambio catiónico y la elución de la proteína LK8 se realiza con un tampón de elución (pH 4,0 – 8,0) que contiene NaCl entre 0 y 5M.

8. Método, según la reivindicación 6, en el que dicha cromatografía de interacción hidrofóbica con un tampón de elución de fosfato sódico entre 0 y 100 mM (pH 4 – 8) que contiene sulfato amónico entre 0,1 y 5M y NaCl entre 0 y 500mM para la elución de la proteína LK8.

 

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