Región reguladora 5'' de oleosina para la modificación de la composición de lípidos de una semilla de una planta.

Un ácido nucleico aislado que codifica una región reguladora 5' de oleosina que dirige la expresión específica desemillas que consiste en la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID Nº:12.

Región reguladora 5’ de oleosina para la modificación de la composición de lípidos de una semilla de una planta Antecedentes de la invención El contenido en aceite de semillas se ha modificado tradicionalmente mediante el cultivo de la planta. El uso de tecnología de ADN recombinante para modificar la composición de aceite en semillas puede acelerar este proceso y en algunos casos modificar los aceites de las semillas de un modo que no puede realizarse mediante solo el cultivo. La composición en aceite de Brassica se ha alterado significativamente modificando la expresión de un número de genes del metabolismo de lípidos. Dichas manipulaciones de la composición del aceite de semillas se han enfocado en alterar la proporción del componente endógeno de ácidos grasos. Por ejemplo, la represión antisentido del gen !12-desaturasa en semillas transgénicas de colza ha dado como resultado un aumento de ácido oleico de hasta el 83 %. Topfer y col. 1995 Science 268:681-686.

Ha habido algunos intentos exitosos de modificación de la composición de aceite en semillas de plantas transgénicas mediante la introducción de genes nuevos que permiten la producción de un ácido graso que las plantas huéspedes no eran capaces de sintetizar previamente. Van de Loo y col. (1995 Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:6743-6747) han sido capaces de introducir un gen AI2-hidroxilasa en tabaco transgénico, dando como resultando la introducción de un ácido graso novedoso, ácido ricinoleico, en el aceite de sus semillas. La acumulación de la que se ha informado era modesta en plantas que portan constructos en los que la transcripción del gen hidroxilasa esta bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) . De forma similar, las plantas de tabaco se han manipulado para que produzcan niveles bajos de ácido petroselínico mediante expresión de una acil-ACP desaturasa de cilantro (Cahoon y col. 1992 Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:11184-11188) ,

Los ácidos grasos de cadena larga (C18 y más grandes) tienen un valor económico significativo como alimentos de importancia nutricional y médica y como materias primas industriales (Ohlrogge.J.B. 1994 Plant Physiol. 104:821826) . El ácido linoleico (18:2 !9, 12) y α-linoleico (18:3 !9, 12, 15) son ácidos grasos esenciales que se encuentran en muchos aceites de semillas. Los niveles de estos ácidos grasos se han manipulado en cultivos de semillas para aceite mediante reproducción y biotecnología (Ohlrogge y col. 1991 Biochim. Biophys. Acta 1082:1-26; Topfer y col. 1995 Science 268:681-686. Adicionalmente, la producción de ácidos grasos novedosos en aceites de semillas puede tener un uso considerable en la salud de seres humanos y en aplicaciones industriales.

Se cree que el consumo de aceites vegetales ricos en ácido γ-linolénico (GLA) (18:3 !6, 9, 12) alivia la hipercolesterolemia y otros trastornos clínicos relacionados que se correlacionan con la susceptibilidad a una enfermedad cardiaca coronaria (Brenner R.R. 1976 Adv. Exp. Med. Biol. 83:85-101) . Los beneficios terapéuticos de GLA dietético pueden ser resultado de su papel como precursor en la síntesis de prostaglandinas (Weete, J.D. 1980, en Lipid Biochemistr y of Fungi and Other Organisms, eds. Plenum Press, Nueva York, páginas 59-62) . El ácido linoleico (18:2) (LA) se transforma en ácido gamma-linolénico (18.3) (GLA) por medio de la enzima !6-desaturasa.

Pocos aceites de semillas contienen GLA aunque tengan altos contenidos del precursor ácido linoleico. Esto es debido a la ausencia de actividad de !6-desaturasa en la mayor parte de las plantas. Por ejemplo, solo borraja (Borago officinalis) , onagra (Oenothera biennis) y las grosellas (Ribes nigrum) producen cantidades apreciables de ácido linolénico. De estas tres especies solo Oenothera y borraja se cultivan como fuente comercial de GLA. Sería beneficioso si los aceites de semillas agronómicas pudieran manipularse para producir GLA en cantidades significativas introduciendo un gen heterólogo de !6-desaturasa. También sería beneficioso si otros productos de expresión asociados con la síntesis de ácidos grasos y el metabolismo de lípidos pudieran producirse en plantas a niveles suficientemente altos para que sea factible la producción comercial de un producto de expresión particular.

Tal como se divulga en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.552.306, recientemente se ha aislado un gen de !6-desaturasa cianobacteriano. La expresión de este gen cianobacteriano en tabaco transgénico dio como resultado una acumulación significativa pero a un nivel bajo de GLA. (Reddy y col. 1996 Nature Biotech. 14:639642) . La solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0078845 en trámite del solicitante divulga un gen de !6desaturasa aislado a partir de una planta de Borago officinalis y su expresión en tabaco bajo el control del promotor 35S del CaMV. Dicha expresión dio como resultado un nivel significativo pero bajo de GLA y la acumulación de ácido octadecatetraenoico (ODTA o OTA) en semillas. Por lo tanto, existe la necesidad de un promotor que funcione en plantas y que dirija de forma consecuente la expresión de alto nivel de genes del metabolismo de lípidos en semillas de plantas transgénicas.

Las oleosinas son proteínas de semillas abundantes asociadas con la membrana monocapa de fosfolípidos de cuerpos oleosos. El primer gen de oleosina, L3, se clonó a partir de maíz seleccionando clones cuyos productos traducidos in vitro se reconocieron usando un anticuerpo anti-L3 (Vance y col. 1987 J. Biol. Chem. 262:1127511279) . Subsiguientemente, se clonaron isoformas diferentes de genes de oleosina a partir de especies diferentes de Brassica, soja, zanahoria, pino y Arabidopsis (Huang, A.H.C., 1992, Ann. Reviews Plant Phys. and Plant Mol. Biol. 43:177-200; Kirik y col., 1996 Plant Mol. Biol. 31:413-417; Van Rooijen y col., 1992 Plant Mol. Biol. 18:11771179; Zou y col., Plant Mol. Biol. 31:429-433, Plant y col., Plant Mol. Biol. 25:193-205. Las secuencias de proteína de oleosina previstas a partir de estos genes están muy conservadas, especialmente por el dominio hidrófobo central.

Todas estas oleosinas tienen el rasgo caracterizador de tres dominios diferentes. Un dominio anfipático de 40-60 aminoácidos está presente en el extremo N-terminal; un dominio totalmente hidrófobo de 68-74 aminoácidos está ubicado en el centro; y un dominio antifático de hélice α de 33-40 aminoácidos está situado en el extremo C-terminal (Huang A.H.C. 1992) .

La presente invención proporciona secuencias reguladoras 5' a partir de genes de oleosina que dirigen la expresión a alto nivel de genes del metabolismo de lípidos en plantas transgénicas. Según la invención, se proporcionan constructos quiméricos que comprenden una región reguladora 5’ de oleosina unida operativamente a una secuencia codificante de un gen del metabolismo de lípidos tal como un gen de !12-desaturasa o de !15-desaturasa. Las plantas transgénicas que comprenden los constructos quiméricos objeto producen niveles de GLA que se acercan al nivel encontrado en las pocas especies de plantas que producen de forma natural GLA tal como la onagra (Oenothera biennis) .

Sumario de la invención La presente invención se refiere a una región reguladora 5' de un gen de oleosina de Arabidopsis.La región reguladora 5', cuando está unida operativamente a bien la secuencia codificante de un gen heterólogo o bien la secuencia complementaria de un gen vegetal nativo, dirige la expresión del gen heterólogo o secuencia complementaria en una semilla vegetal.

La presente invención proporciona, por lo tanto, casetes de expresión y vectores de expresión que comprenden una región reguladora 5' de oleosina unida operativamente a un gen heterólogo o una secuencia complementaria a un gen vegetal nativo.

Se proporcionan también vectores de transformación vegetales que comprenden los casetes de expresión y vectores de expresión, así como células vegetales transformadas por estos vectores, y plantas y su progenie que contienen los vectores.

En una realización de la invención, el gen heterólogo o la secuencia génica complementaria es un gen de la síntesis de ácidos grasos o un gen del metabolismo de lípidos.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una planta con niveles aumentados de un producto de un gen de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo de lípidos.

En particular, se proporciona un procedimiento para producir una planta con niveles aumentados de un gen de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo de lípidos transformando una planta con los casetes de expresión y los vectores de expresión objeto que comprenden una región reguladora... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una región reguladora 5' de oleosina que dirige la expresión específica de semillas que consiste en la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID Nº:12.

2. Un casete de expresión que comprende la región reguladora 5' de oleosina de la reivindicación 1 unido

operativamente a al menos uno entre un ácido nucleico que codifica un gen heterólogo o un ácido nucleico que codifica una secuencia complementaria a un gen vegetal nativo.

3. El casete de expresión de la reivindicación 2 en el que el gen heterólogo es al menos uno de un gen de la síntesis de ácidos grasos o un gen del metabolismo de lípidos.

4. El casete de expresión de la reivindicación 3 en el que el gen heterólogo se selecciona del grupo que consiste

en un gen de acetil-coA carboxilasa, un gen de cetoacil sintasa, un gen de malonil transacilasa, un gen de lípido desaturasa, un gen de proteína transportadora de acilos (ACP) , un gen de tioesterasa, un gen de acetil transacilasa o un gen de elongasa.

5. El casete de expresión de la reivindicación 4 en el que el gen de lípido desaturasa se selecciona del grupo que consiste en un gen de !12-desaturasa y un gen de !15-desaturasa.

6. Un vector de expresión que comprende el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

7. Una célula que comprende el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

8. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.

9. La célula de la reivindicación 7 u 8 en la que dicha célula es una célula bacteriana o una célula vegetal.

10. Una planta transgénica que comprende el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5. 20 11. Una planta transgénica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.

12. La planta de la reivindicación 10 u 11 en la que dicha planta es al menos una de entre una planta de girasol, soja, maíz, algodón, tabaco, cacahuete, colza o Arabidopsis.

13. Progenie de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 caracterizada porque comprende el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o el vector de la reivindicación 6.

14. Semilla de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 caracterizada porque comprende el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o el vector de la reivindicación 6.

15. Un procedimiento de producción de una planta con niveles aumentados de un producto de un gen de la síntesis de ácidos grasos o un gen del metabolismo de lípidos que comprende:

(a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 unido operativamente a al menos uno de entre un ácido nucleico aislado que codifica un gen de la síntesis de ácidos grasos o un gen del metabolismo de lípidos; y

(b) regenerar una planta con niveles aumentados del producto de dicho gen de la síntesis de ácidos grasos

o dicho gen del metabolismo de lípidos a partir de dicha célula vegetal.

16. El procedimiento de la reivindicación 15 en el que dicho gen de la síntesis de ácidos grasos o dicho gen del

metabolismo de lípidos es al menos uno de entre un gen de lípido desaturase, un gen de proteína transporatadora de acilos (ACP) , un gen de tioesterasa, un gen de elongasa, un gen de acetil transacilasa, un gen de acetil-coA-carboxilasa, un gen de cetoacil sintasa o un gen de malonil transacilasa.

17. Un procedimiento de producción reducida de un gen de la síntesis de ácido graso o del metabolismo de lípidos en una planta que comprende:

(a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 unido operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a un gen de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo de lípidos; y

(b) regenerar una planta con producción reducida de dicho gen de la síntesis de ácidos grasos o de dicho gen del metabolismo de lípidos.

18. Un procedimiento de cosupresión de un gen nativo de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo de lípidos en una planta que comprende:

(a) transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado

de la reivindicación 1 unido operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo de lípidos nativo de la planta; y

(b) regenerar una planta con producción reducida de dicho gen de la síntesis de ácidos grasos o de dicho gen del metabolismo de lípidos.