Un procedimiento para la preparación de una vacuna antigripal a partir de virus de la gripe que se desarrolla en uncultivo de una línea celular de mamífero,

que comprende una etapa en la cual el virus sembrado y/o la vacuna y/o elcultivo se ensaya para determinar la presencia de un agente infeccioso que puede desarrollarse en dicha líneacelular, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso seselecciona del grupo que consiste en: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavirus de lafamilia Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus depolioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae;Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus y bacterias Chlamydia.

Reducción de riesgos iatrogénicos potenciales asociados a las vacunas antigripales.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la producción y control de calidad de vacunas contra el virus de la gripe.

Antecedentes de la técnica

Los virus de la gripe para uso en la preparación de vacunas para seres humanos se han desarrollado tradicionalmente en huevos de gallina embrionados, aunque las técnicas más modernas desarrollan el virus en cultivos celulares de mamífero, por ejemplo, en células Vero, células MDCK o células PER.C6. El cambio en el substrato de crecimiento del virus ha proporcionado una oportunidad para una nueva evaluación reglamentaria de la seguridad de la vacuna antigripal. Por ejemplo, la contaminación con ADN de la célula hospedadora ha sido una objeción reglamentaria en las vacunas obtenidas a partir de células [1], pero no ha sido una objeción en el pasado para las vacunas desarrolladas en huevos.

Levandowski (Developments in Biological Standardization, vol. 98, págs. 171-75, (1999) ) , expone principios de seguridad relacionados con la producción de la vacuna antigripal en cultivos de células (Vero, MDCK) . Se reconoce el problema de agentes accidentales replicantes en líneas celulares pero no en huevos. Por ello, se sugiere rastrear las fuentes originales de virus de la gripe, así como los cultivos celulares a la búsqueda de ciertos agentes víricos.

Los principios de seguridad que rodean a las vacunas antigripales obtenidas a partir de huevos son, por lo tanto, diferentes de los que rodean a las vacunas desarrolladas en cultivos celulares, estando las vacunas obtenidas a partir de células bajo una vigilancia más atenta. Es un objeto de la invención abordar estos asuntos de seguridad diferentes, y en particular, el de proporcionar procedimientos para aumentar la seguridad del desarrollo de vacunas antigripales en cultivos celulares.

Divulgación de la invención Por definición, el uso de substratos de células de mamífero para la producción de la vacuna antigripal implica el cultivo celular en condiciones que sean perfectamente adecuadas para el desarrollo y la replicación vírica. El inventor ha comprobado que estas condiciones aumentan el riesgo de que puedan desarrollarse patógenos diferentes del virus de la gripe en el cultivo celular, dando lugar, con ello, a la contaminación potencial del producto de vacuna final. Los ensayos de contaminación no son, por lo general, difíciles de llevar a cabo, pero un fabricante debe saber primero qué tipo de ensayos hay que realizar. El inventor ha identificado riesgos de contaminación específicos, y su trabajo indica que pueden llevarse a cabo ensayos adecuados durante la fabricación con el fin de garantizar la seguridad y calidad de las vacunas antigripales desarrolladas en cultivos celulares. Algunos de los contaminantes pueden ser inocuos en un producto de vacuna final, pero su presencia puede interferir con la propagación y purificación posterior del virus de la gripe, de ahí que su eliminación sea un asunto primordial para la calidad y reproducibilidad; otros contaminantes serían perjudiciales en una vacuna final, de ahí que su eliminación sea un asunto de seguridad primordial.

El riesgo de contaminación que surge del cocultivo viral no carece de precedentes (por ejemplo, ciertos lotes de las primeras vacunas del virus de la polio se contaminaron con virus de simio 40 (“SV40”) , un virus de polioma) , pero no existía ninguna divulgación previa sobre la identificación de riesgos específicos asociados con el cultivo celular para la producción de la vacuna antigripal humana. Los virus de la gripe desarrollados en cultivos celulares tienen un riesgo particular de contaminación debido a que las cepas usadas para la producción de la vacuna están cambiando cada año y, en consecuencia, han de establecerse nuevos cultivos cada año. Este cambio anual en los materiales de producción significa que cada nuevo año entraña un nuevo riesgo de contaminación, particularmente debido a que durante la preparación de virus sembrados por los fabricantes están implicados múltiples pases, aumentado así el riesgo de desarrollo paralelo de agentes patógenos accidentales.

El inventor ha identificado agentes infecciosos que pueden desarrollarse en las condiciones usadas para el desarrollo del virus de la gripe en cultivos celulares, pero que no se desarrollan en huevos de gallina. Estos agentes infecciosos representan un nuevo riesgo de contaminación para las vacunas antigripales que nunca ha sido un problema para las vacunas antigripales tradicionales. Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna antigripal a partir de virus de la gripe que se desarrolla en un cultivo de una línea de células de mamífero, que comprende una etapa en la cual se ensaya la vacuna y/o el cultivo para determinar la presencia de un agente infeccioso que puede desarrollarse en dicha línea de células, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavirus de la familia Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus de polioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae; Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus y bacterias Chlamydia.

El inventor ha identificado igualmente agentes infecciosos que se desarrollan en algunos substratos de células usados para la producción de vacuna antigripal pero que no se desarrollan en otros. De acuerdo con ello, estos agentes infecciosos son un riesgo de contaminación únicamente para ciertas vacunas antigripales.

La línea de células de mamífero

Las vacunas antigripales de la invención se desarrollan en líneas celulares de mamífero y no en huevos embrionados. Las líneas celulares de mamífero típicas usadas en la producción de productos biológicos son: MDCK; CHO; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Las líneas celulares de mamífero preferidas para el desarrollo de virus de la gripe son: células MD-CK [2-5], obtenidas a partir de riñón canino Madin Darby; células Vero [6-8], obtenidas a partir del mono verde africano (Cercopithecus aethiops) o células PER.C6 [9], obtenidas a partir de retinoblastos embrionarios humanos.

Estas líneas celulares se encuentran ampliamente disponibles, por ejemplo, en la colección del American Type Cell Culture (ATCC) [10], o en el Coriell Cell Repositories [11]. Por ejemplo, la ATCC suministra diversas células Vero diferentes con los números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 y CRL-1587 y suministra células MDCK con el número de catálogo CCL-34.

Además de ser útil por el material obtenido del desarrollo en líneas celulares de mamífero, la invención también puede ampliarse al material derivado del desarrollo en líneas celulares aviares [por ej., ref. 12 y 13], incluidas las líneas celulares derivadas de gallinas, por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo (CEF) , etc.

Agentes infecciosos que no se desarrollan en huevos de gallina embrionados El inventor ha identificado una variedad de patógenos que pueden desarrollarse en líneas celulares de mamífero (en particular, tanto en células MDCK como en células Vero) usadas para la preparación de virus de la gripe para la producción de vacunas, pero que no se desarrollan en huevos de gallina. El ensayo de contaminación por estos patógenos no era necesario para las vacunas preparadas sobre el substrato de huevo tradicional, pero el inventor ha comprobado que el control de calidad de las vacunas debería incluir ensayos para uno o más de estos patógenos con el fin de garantizar el cumplimiento de las normas de seguridad más exigentes. Los patógenos son los siguientes:

•Pneumovirinae, tales como los del género Pneumovirus, incluyendo el virus sincitial respiratorio (RSV) .

•Morbilivirus de la familia Paramyxoviridae, tal como el virus del sarampión.

• Enterovirus de la familia Picornaviridae, tal como el virus Coxsackie, virus ECHO y enterovirus, aunque algunos virus Coxsackie (por ejemplo, B3, B4) se ha visto que no se desarrollan en células MDCK.

•Reoviridae de mamífero, en particular ortoreovirus (por ejemplo, reovirus de mamífero) y rotavirus. Los reovirus pueden mostrar desarrollo no limitado en células Vero y MDCK, y en consecuencia, el ensayo de los mismos es de particular importancia. Los rotavirus comparten... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de una vacuna antigripal a partir de virus de la gripe que se desarrolla en un cultivo de una línea celular de mamífero, que comprende una etapa en la cual el virus sembrado y/o la vacuna y/o el cultivo se ensaya para determinar la presencia de un agente infeccioso que puede desarrollarse en dicha línea celular, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavirus de la familia Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus de polioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae; Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus y bacterias Chlamydia.

2. Un procedimiento para la preparación de una vacuna antigripal a partir de virus de la gripe que se desarrolla en un cultivo de una línea celular de mamífero, que comprende una etapa en la cual la vacuna y/o el cultivo se trata para eliminar y/o inactivar un agente infeccioso que puede desarrollarse en la línea celular, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavirus de la familia Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus de polioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae; Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus y bacterias Chlamydia.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la línea celular de mamífero es una línea celular MDCK, una línea celular Vero o una línea celular PER.C6.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además una o más de las etapas siguientes: una etapa de inactivación; una etapa de mezclado de tres cepas de virus para obtener una vacuna trivalente; una etapa de formulación de la vacuna para inyección; una etapa de combinación de la vacuna con un adyuvante; una etapa de medición del contenido en HA; una etapa de ajuste del contenido en HA, por ejemplo, por dilución; una etapa de adición de un conservante; una etapa de eliminación de los ácidos nucleicos de la célula hospedadora residuales.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una etapa en la que la vacuna y/o el cultivo se ensaya para determinar la presencia de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en virus parainfluenza; Herpesviridae; Mycoplasma y circovirus aviar.

6. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además otra etapa en la que después de dicha eliminación y/o inactivación, la vacuna y/o el cultivo se ensaya para determinar la presencia de dicho agente infeccioso.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo se ensaya mediante detección inmunoquímica y/o detección de ácido nucleico.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la detección es mediante ELISA y/o PCR (incluida la RT-PCR) .