Receptores acoplados a proteínas G mutantes y métodos para seleccionarlos.

Método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) con estabilidad conformacional aumentada,

comprendiendo el método

(a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(b) seleccionar un ligando de una clase particular, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular,

(c) determinar si el GPCR o cada GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad conformacional del GPCR original con respecto a la unión a ese ligando, midiendo la desnaturalización manifestada por la pérdida de capacidad de unión al ligando, en condiciones de desnaturalización tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un extremo de pH, y

(d) seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado; en el que la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) corresponde a la misma clase de ligando que el ligando seleccionado en la etapa (b) .

Receptores acoplados a proteínas G mutantes y métodos para seleccionarlos La presente invención se refiere a receptores acoplados a proteínas G mutantes (GPCR) y métodos para seleccionar aquéllos con estabilidad aumentada. En particular, se refiere a la selección y preparación de GPCR mutantes que tienen estabilidad aumentada en una condición particular en comparación con sus proteínas originales respectivas. Es más probable que las proteínas de este tipo sean cristalizables, y por tanto susceptibles de determinación estructural, que las proteínas originales. También son útiles para estudios de desarrollo y descubrimiento de fármacos.

A lo largo de los últimos 20 años la tasa de determinación de estructuras de proteína de membrana ha aumentado gradualmente, pero el mayor éxito se ha conseguido en la cristalización de proteínas de membrana de bacterias más que de eucariotas [1]. Han sido más fácil sobreexpresar las proteínas de membrana bacterianas usando técnicas convencionales en Escherichia coli que las proteínas de membrana eucariotas [2, 3] y las proteínas bacterianas son a veces mucho más estables en detergente, siendo la estabilidad en detergente un requisito previo esencial para la purificación y cristalización. Proyectos de secuenciación de genoma también han permitido la clonación y expresión de muchos homólogos de un canal iónico o transportador específico, lo que también mejora mucho las posibilidades de éxito durante la cristalización. Sin embargo, de las 120 estructuras de proteína de membrana diferentes que se han resuelto a la fecha, sólo hay siete estructuras de proteínas integrales de membrana de mamífero (http://blanco.biomol.uci.edu/) ; cinco de estas proteínas de membrana se purificaron a partir de fuentes naturales y son estables en disoluciones de detergente. Aparte de las dificultades en la sobreexpresión de proteínas de membrana eucariotas, a menudo tienen poca estabilidad en disoluciones de detergente, lo que restringe gravemente el intervalo de condiciones de cristalización que pueden explorarse sin su precipitación o desnaturalización inmediata. De manera ideal, las proteínas de membrana deben ser estables durante muchos días en cualquier disolución de detergente dada, pero los detergentes que son los más adecuados para hacer crecer cristales con calidad de difracción tienden a ser los detergentes más desestabilizantes, es decir, aquéllos con cadenas alifáticas cortas y grupos de cabeza cargados o pequeños. También nos gustaría resolver las estructuras de proteínas de membrana humanas, debido a que éstas se requieren por la industria farmacéutica para ayudar el desarrollo de agentes terapéuticos; a menudo hay diferencias sustanciales en la farmacología de receptores, canales y transportadores de diferentes mamíferos, mientras que los genomas de levaduras y bacterias pueden no incluir ninguna proteína homóloga. Existe por tanto la necesidad abrumadora de desarrollar una estrategia genérica que permita la producción de proteínas integrales de membrana eucariotas estables en detergente para la cristalización y determinación estructural y potencialmente para otros fines tales como aplicaciones de selección de fármacos, bioensayos y biosensores.

Las proteínas de membrana han evolucionado hasta ser suficientemente estables en la membrana para asegurar la viabilidad celular, pero no han evolucionado hasta ser estables en disolución de detergente, sugiriendo que las proteínas de membrana podrían ser mutantes estables al detergente y desarrollados artificialmente aislados [4]. Esto se demostró posteriormente para dos proteínas bacterianas, diacilglicerol cinasa (DGK) [5, 6] y bacteriorrodopsina [7]. La mutagénesis al azar de DGK identificó mutaciones puntuales específicas que aumentaban la termoestabilidad y, cuando se combinaban, el efecto era aditivo de modo que el mutante estable de manera óptima tenía una semivida de 35 minutos a 80ºC en comparación con una semivida de 6 minutos a 55ºC para la proteína nativa [6]. Se demostró que el trímero del mutante DGK resistente al detergente se había vuelto estable en SDS y, por tanto, es probable que la estabilización del estado oligomérico desempeñara un papel significativo en la termoestabilización. Aunque el objetivo de la mutagénesis era producir una proteína de membrana adecuada para la cristalización, la estructura de DGK aún tiene que determinarse y no ha habido notificaciones de cristalización satisfactoria. Un estudio adicional sobre la bacteriorrodopsina mediante mutagénesis de exploración de cisteína a lo largo de la hélice B demostró que no era posible predecir qué residuos de aminoácido conducirían a la termoestabilidad tras la mutación ni, cuando se estudió en el contexto de la estructura, estaba claro por qué se había producido la termoestabilización [7].

Los GPCR constituyen una familia muy grande de proteínas que controlan muchos procesos fisiológicos y son las dianas de muchos fármacos eficaces. Por tanto, son de considerable importancia farmacológica. Una lista de GPCR se proporciona en Foord et al. (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288. Los GPCR son generalmente inestables cuando se aíslan, y a pesar de esfuerzos considerables, no ha sido posible cristalizar ninguno excepto la rodopsina bovina, que naturalmente es excepcionalmente estable.

Los GPCR son posibles dianas farmacológicas, y se hace referencia particularmente a Overington et al. (2006) Nature Rev. Drug Discover y 5, 993-996 que indica que más de un cuarto de los fármacos presentes tienen un GPCR como diana.

Se cree que los GPCR existen en múltiples conformaciones distintas que están asociadas con diferentes clases farmacológicas del ligando tales como agonistas y antagonistas, y que fluctúan de manera cíclica entre estas conformaciones con el fin de funcionar (Kenakin T. (1997) Ann NY Acad Sci 812, 116-125) .

Se apreciará que los métodos de la invención no incluyen un método tal como se describió en D'Antona et al., que incluye la unión de [3H]CP55940 a un receptor 1 cannabinoide humano mutante constitutivamente inactivo (T210A) en el que el residuo Thr en la posición 210 se sustituye por un residuo Ala.

La enumeración o discusión de un documento aparentemente publicado anteriormente en esta memoria descriptiva no debe necesariamente tomarse como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es conocimiento común general.

Se ha comprendido que existen dos problemas serios asociados con tratar de cristalizar los GPCR, concretamente su falta de estabilidad en detergente y el hecho de que existen en múltiples conformaciones. Con el fin de funcionar, los GPCR han evolucionado para fluctuar de manera cíclica por al menos dos conformaciones distintas, la forma unida al agonista y la forma unida al antagonista, y en ausencia de ligando pueden producirse espontáneamente cambios entre estas dos conformaciones. Es por tanto probable que cualquier receptor purificado presente una mezcla de conformaciones. La adición simplemente de ligandos a los GPCR durante ensayos de cristalización no ha dado como resultado la determinación de su estructura. Para mejorar la probabilidad de cristalización, se seleccionaron por tanto mutaciones que mejoraron la estabilidad del GPCR y, además, bloquearon preferentemente el receptor en una conformación biológicamente relevante específica.

Se decidió ver si era posible la estabilización de un GPCR en una conformación biológicamente relevante particular y si el efecto era suficientemente grande como para mejorar significativamente las probabilidades de obtener cristales con calidad de difracción. En el ejemplo 1, se eligió el receptor β1-adrenérgico (βAR) de eritrocitos de pavo [8] como sujeto de prueba para este estudio por varios motivos. El βAR es un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) que tiene una farmacología bien desarrollada con muchos ligandos disponibles comercialmente y en una forma radiomarcada. Además, la sobreexpresión de βAR ha sido particularmente satisfactoria usando el sistema de expresión de baculovirus y puede purificarse en cantidades de miligramos en una forma funcional [9]. En el ejemplo 2, se usó un receptor de adenosina humano, y en el ejemplo 3, se usó un receptor de neurotensina de rata.

Método para seleccionar GPCR mutantes con estabilidad aumentada Un primer aspecto de la invención proporciona un método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) mutante con estabilidad conformacional aumentada, comprendiendo el método

(a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(b) seleccionar... [Seguir leyendo]

1. Método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) con estabilidad conformacional aumentada, comprendiendo el método 5

(a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(b) seleccionar un ligando de una clase particular, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular,

(c) determinar si el GPCR o cada GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad conformacional del GPCR original con respecto a la unión a ese ligando, midiendo la desnaturalización manifestada por la pérdida de capacidad de unión al ligando, en condiciones de desnaturalización tales como calor, un detergente, un agente

caotrópico o un extremo de pH, y (d) seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado; en el que la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) corresponde a la misma clase de ligando que el ligando seleccionado en la etapa (b) .

2. Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más mutantes se ponen en contacto con el ligando seleccionado antes de la etapa (c) .

25 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el uno o más mutantes se proporcionan en forma solubilizada.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el ligando seleccionado es de la clase agonista de ligandos y la conformación particular es una conformación agonista, o el ligando seleccionado es de la clase antagonista de ligandos y la conformación particular es una conformación antagonista.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el ligando seleccionado es de la clase agonista de ligandos y la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) es la conformación agonista.

35 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la afinidad de unión del mutante por el ligando seleccionado es sustancialmente igual o mayor que la afinidad de unión del original por el ligando seleccionado.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, repitiéndose el método durante una o más rondas, representando los mutantes seleccionados que tienen estabilidad conformacional aumentada en la etapa (a) el GPCR original en una ronda posterior del método.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se selecciona un GPCR mutante que tiene estabilidad aumentada con respecto a uno cualquiera o más de calor, un detergente, un agente caotrópico y 45 un extremo de pH.

9. Método según la reivindicación 8, en el que se selecciona un GPCR mutante con termoestabilidad aumentada.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el ligando es uno cualquiera de un agonista completo, un agonista parcial, un agonista inverso, un antagonista.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ligando es un polipéptido que se une al

GPCR. 55

12. Método según la reivindicación 11, en el que el polipéptido es cualquiera de un anticuerpo, una anquirina, una proteína G, una proteína RGS, una arrestina, una GPCR cinasa, una receptor tirosina cinasa, una RAMP, un NSF, un GPCR, una subunidad NR1 o NR2a del receptor NMDA, o calciona, un marco de dominio de fibronectina, o un fragmento o derivado del mismo que se une al GPCR.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que en la etapa (b) se seleccionan dos o más ligandos, la presencia de cada uno de los cuales provoca que el GPCR se encuentre en la misma conformación particular.

65 14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se selecciona un GPCR mutante que tiene capacidad reducida para unirse a un ligando de una clase diferente al ligando seleccionado en la etapa (b) en comparación con su original.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el GPCR es uno cualquiera de un receptor β-adrenérgico, un receptor de adenosina y un receptor de neurotensina. 5

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el ligando está marcado de manera detectable.

17. Método según la reivindicación 16, en el que el ligando está marcado de manera fluorescente. 10

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la etapa (c) implica el uso de FRET.

19. Método para preparar un GPCR mutante, comprendiendo el método 15 (a) llevar a cabo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18,

(b) identificar la posición o posiciones del residuo o los residuos de aminoácido mutados en el GPCR mutante o los GPCR mutantes que se ha (n) seleccionado por la estabilidad conformacional aumentada, y (c) sintetizar un GPCR mutante que contiene un aminoácido de sustitución en una o más de las posiciones identificadas.

20. Método según la reivindicación 19, en el que el GPCR mutante contiene una pluralidad de mutaciones en comparación con el GPCR original. 25

21. Método según la reivindicación 1 ó 19, en el que se determina si el GPCR mutante seleccionado o preparado puede acoplarse a una proteína G.

22. Método según la reivindicación 1 ó 19, en el que se determina si el GPCR mutante seleccionado o

preparado puede unirse a una pluralidad de ligandos de la misma clase que el ligando seleccionado con un orden de rango y/o amplitud de afinidad comparables a los del GPCR original.