Purificación de proteínas recombinantes fusionadas con epítopos múltiples.

Polipéptido de identificación para ser usado en la purificación de una molécula de péptido diana,

en el que el polipéptido de identificación comprende la secuencia de aminoácidos en la que: D, Y y K son sus aminoácidos representativos; X 20 es hidrógeno o un enlace; X 20 -(X 1 -Y-K-X 2 -X 3 -D-X 4 ) n-X 5 -(X 1 -Y-K-X 7 -X 8 -D-X 9 -K)-X 21 X 21 es hidrógeno o un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido diana; cada X 1 y X 4 es de forma independiente un enlace o por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; cada X 2 , X 3 , X 7 y X 8 es de forma independiente un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; X 5 es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de aminoácido; X 9 es un enlace o un residuo de aspartato; y n es por lo menos 2, y en el que el sitio escindible representado por la secuencia X 7 -X 8 -D-X 9 -K no está situado en el, o interpuesto entre múltiples copias del, dominio antigénico X 1 -Y-K-X 2 -X 3 -D.

Purificación de proteínas recombinantes fusionadas con epítopos múltiples Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a etiquetas de proteínas y a métodos de purificación de proteínas que usan varias técnicas de ADN recombinante. Más particularmente, la invención trata sobre polipéptidos de identificación novedosos y vectores de ADN que codifican polipéptidos de identificación novedosos que contienen múltiples dominios antigénicos unidos en tándem. Se proporcionan también métodos para usar dichos polipéptidos de identificación para la purificación de péptidos diana y métodos de construcción de vectores de ADN que codifican los polipéptidos de identificación novedosos y vectores de expresión de ADN que codifican los polipéptidos de identificación unidos a un péptido diana.

Antecedentes de la invención [0002] Las moléculas proteicas tales como enzimas, hormonas, proteínas de almacenamiento, proteínas de unión, proteínas transportadoras y proteínas transductoras de señales se pueden producir y purificar usando varias técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican una proteína seleccionada, junto con secuencias de ADN apropiadas para un promotor y un sitio de unión al ribosoma se ligan a un plásmido vector. El plásmido se inserta dentro de una célula procariota o eucariota hospedadora. Las células hospedadoras transformadas se identifican, se aíslan y a continuación se cultivan para conseguir la expresión de las moléculas proteicas. Uno de los métodos usados para purificar polipéptidos híbridos es el sistema de poli-arginina en el que un polipéptido híbrido se purifica selectivamente sobre una resina de intercambio catiónico. Véase Sassenfeld, H. M. y Brewer, S. J. BioTechnology, 2:76 (1984) ; patente U.S. n.º 4.532.207. Sassenfeld y Brewer dieron a conocer una extensión del carboxi terminal de cinco residuos de arginina fusionados en una proteína diana. Esta extensión de poliarginina básica permitió la purificación del polipéptido híbrido sobre una resina SP-Sephadex. Un sistema análogo de expresión y purificación de proteínas utiliza una cola o etiqueta de polihistidina en el extremo o bien amino o bien carboxi del polipéptido híbrido. La proteína de fusión se purifica por cromatografía sobre una resina de afinidad metálica con Ni2+. Véase Porath, J., Protein Expression and Purification, 3:7995 (1992) . Adicionalmente, actualmente se utilizan varios protocolos de purificación por afinidad para facilitar el aislamiento de proteínas de fusión. La cromatografía de afinidad se basa en la capacidad de las proteínas a unirse de forma específica y no covalente con un ligando. Usada por sí sola, puede aislar proteínas de mezclas muy complejas con no solamente un mayor grado de purificación que el posible mediante la cromatografía secuencial de intercambio iónico y en columna de gel, sino también sin pérdidas significativas de actividad. Típicamente, como socio de fusión se selecciona un ligando capaz de unirse con una alta especificidad a una matriz de afinidad. Por ejemplo, la p-aminofenil-β-D-tiogalactosidil-succinildiaminohexil-Sefarosa se une selectivamente a la β-galactosidasa permitiendo la purificación de proteínas de fusión a β-gal. Véase Germino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6848 (1983) . Otros sistemas de expresión que permiten la purificación por afinidad de proteínas de fusión incluyen proteínas de fusión realizadas con glutatión-S-transferasa, que se recuperan selectivamente en glutatión-agarosa. Véase Smith,

D. B. y Johnson., K. S. Gene 67:31 (1988) . La IgG-Sefarosa se puede usar para purificar por afinidad proteínas de fusión que contienen la proteína estafilocócica A. Véase Uhlen, M. et al. Gene 23:369 (1983) . El dominio de la proteína de unión a maltosa del gen malE de E. coli se ha usado como socio de fusión y permite la purificación por afinidad de la proteína de fusión sobre resinas de amilasa.

Otro método usado para detectar y aislar proteínas es mediante el uso de un epítopo etiqueta. El etiquetado con epítopos utiliza anticuerpos contra péptidos huéspedes para estudiar la localización de la proteína en el nivel celular y niveles subcelulares. Véase Kolodziej, P. A. y Young, RA., Methods Enzymol., 194:508-519 (1991) . Usando la tecnología del ADN recombinante, una secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo se inserta en la región codificante del gel clonado, y el gen híbrido se introduce en una célula mediante un método tal como transformación. Cuando se expresa el gen híbrido, el resultado es una proteína quimérica que contiene el epítopo como péptido huésped. Si el epítopo queda expuesto en la superficie de la proteína, el mismo queda disponible para su reconocimiento por el anticuerpo específico del epítopo, permitiendo que el investigador observe la proteína dentro de la célula usando técnicas de inmunofluorescencia u otras técnicas de inmunolocalización. Además, las proteínas de fusión marcadas con dichos epítopos etiquetas se usan frecuentemente para purificar proteínas utilizando técnicas de purificación por afinidad.

De este modo, el etiquetado con epítopos se ha convertido en una herramienta poderosa para la detección y purificación de proteínas expresadas. Véase Kolodziej, P. A. y Young, RA., Methods Enzymol., 194:508-519 (1991) . Se han usado muchos tipos de etiquetas, siendo c-myc y las etiquetas FLAG® dos de los epítopos más populares usados. Véase Evan et al., Mol Cell Biol. 5:3610-3616 (1985) . En general, estos epítopos se fusionan con el extremo amino o carboxi de la proteína expresada consiguiendo que los mismos resulten más accesibles al anticuerpo para su detección y que haya menos probabilidad de provocar perturbaciones estructurales o funcionales importantes.

Forsburg, S.L., et al., Gene, 191:191-195 (1997) describen una serie de vectores para ser usados en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe que permiten la fusión de una proteína de interés a un epítopo HA triple o dominio GST. El epítopo HA se puede situar en el extremo N ó el extremo C bajo tres versiones diferentes del promotor nmt1, para permitir niveles variables de expresión génica.

Nilsson, J., et al. Protein Expression and Purification, 11:1-16 (1997) proporcionan una visón general de etiquetas de afinidad usadas comúnmente que se centran en el uso de fusiones de las etiquetas de afinidad para la detección, purificación, e inmovilización de proteínas recombinantes y que ofrecen algunos ejemplos recientes de aplicaciones específicas para etiquetas de afinidad.

Las proteínas de fusión que tienen el octapéptido FLAG® Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (ID SEC n.º: 1) en el extremo amino se pueden purificar por afinidad sobre una resina de inmunoafinidad que contenga un anticuerpo específico para el octapéptido. Véase Hopp, T. P., et al. Biotechnology, 6:1204 (1988) ; Prickett, K. S., et al., BioTechniques, 7:580 (1989) ; y la patente U.S. n.º 4.851.341. El epítopo etiqueta FLAG® se ha usado eficazmente para detectar y purificar proteínas en sistemas de mamíferos y bacterianos. La secuencia FLAG® original es reconocida por dos anticuerpos, M1, M2, y una secuencia FLAG® con un iniciador metionina fijado es reconocida por un tercer anticuerpo, M5. Los últimos cinco aminoácidos de la secuencia FLAG® son un sitio de reconocimiento para la proteasa enteroquinasa, permitiendo de este modo la eliminación del epítopo FLAG®. El epítopo FLAG® se ha usado en varios sistemas de expresión para la detección y purificación de proteínas heterólogas, por ejemplo, en E. coli (Brizzard et al., BioTechniques, 16:730-735 (1994) ) , Saccharomyces cerevisiae (Lee et al., Nature, 372:739-746 (1994) ; Prickett et al., BioTechniques, 7:580-589 (1989) ) , Drosophila (Xu et al., Development, 117:1223-1237 (1993) ) , Baculovirus (Dent et al., Mol, Cell Biol, 15:4125-4135 (1995) ; Ritchie et al., Biochem Journal, 338:305-10 (1999) ) , y sistemas mamíferos (Overholt et al., Clin. Cancer Res., 3:185-191 (1997) ; Schulte am Esch et al., Biochemistr y , 38:2248-2258 (1999) ) . No obstante, en muchos sistemas de expresión mamíferos, los niveles de expresión de proteínas son bajos, y una detección eficaz de proteínas foráneas expresadas usando métodos establecidos puede resultar difícil.

Por lo tanto, existe una necesidad de un epítopo etiqueta y un sistema de expresión que utilice dichos epítopos etiqueta los cuales permitirían el aumento de la sensibilidad y la detección de proteínas recombinantes.

Resumen de la invención [0009] La presente invención afronta uno o más de los problemas anteriores proporcionando métodos y vehículos que se pueden usar para producir altos... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido de identificación para ser usado en la purificación de una molécula de péptido diana, en el que el polipéptido de identificación comprende la secuencia de aminoácidos 5 X20- (X1-Y-K-X2-X3-D-X4) n-X5- (X1-Y-K-X7-X8-D-X9-K) -X21

en la que: D, Y y K son sus aminoácidos representativos; X20 es hidrógeno o un enlace; X21 es hidrógeno o un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido diana; cada X1 y X4 es de forma independiente un enlace o por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; cada X2, X3, X7 y X8 es de forma independiente un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; X5 es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de aminoácido; X9 es un enlace o un residuo de aspartato; y n es por lo menos 2, y

en el que el sitio escindible representado por la secuencia X7-X8-D-X9-K no está situado en el, o interpuesto entre múltiples copias del, dominio antigénico X1-Y-K-X2-X3-D.

2. Polipéptido de identificación según la reivindicación 1, en el que: X5 es un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de histidina, por lo menos un residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina alternados o múltiples, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, o - (His-X) m-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro.

3. Polipéptido de identificación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que X1 es Asp y X4 es un enlace.

4. Polipéptido de identificación de la reivindicación 3 en el que el polipéptido de identificación comprende además X10 de tal manera que el polipéptido de identificación comprende la secuencia de aminoácidos

X20-X10- (D-Y-K-X2-X3-D) n-X5- (D-Y-K-X7-X8-D-X9-K) -X21 en la que X10 es un enlace, cualquier residuo de aminoácido, o un residuo de metionina.

5. Polipéptido de identificación para ser usado en la purificación de una molécula de péptido diana, en el que el polipéptido de identificación comprende la secuencia de aminoácidos 40 X20- (D-X11-Y-X12-X13) n-X14- (D-X11-Y-X12-X13-D-X15-K) -X21

en la que: D, Y y K son sus aminoácidos representativos; X20 es hidrógeno o un enlace; X21 es hidrógeno o un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido 45 diana; cada X11 es un enlace, cualquier residuo de aminoácido, o un residuo de lisina; cada X12 es un aminoácido seleccionado de grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; cada X13 es un enlace o por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de 50 aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; X14 es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de aminoácido; X15 es un enlace o un residuo de aspartato; y n es por lo menos 2,

en el que el sitio escindible representado por la secuencia X12-X13-D-X15-K no está situado en el, o interpuesto entre múltiples copias del, dominio antigénico D-X11-Y-X12-X13.

6. Polipéptido de identificación según la reivindicación 5, en el que:

X14

es un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de histidina, por lo menos un 60 residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina múltiples o alternados, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, o - (His-X) m-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro.

7. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que X21 es hidrógeno.

8. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el polipéptido comprende además un

péptido diana unido a la secuencia de unión de tal manera que la secuencia de unión está entre las múltiples 5 copias del dominio antigénico y la molécula del péptido diana.

9. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que X21 es un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido diana y el polipéptido comprende además un péptido diana unido a la secuencia de unión de tal manera que la secuencia de unión está entre las múltiples copias del dominio antigénico y la molécula del péptido diana.

10. Segmento de ADN que codifica un polipéptido de identificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Vector de expresión de ADN que comprende ADN que codifica un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido diana y un polipéptido de identificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Vector de expresión de ADN de la reivindicación 11 en el que el ADN que codifica un polipéptido híbrido comprende además un sitio de clonación múltiple que comprende sitios de reconocimiento de enzimas de 20 restricción múltiples.

13. Método para producir un péptido diana, que comprende:

a. se transforman células hospedadoras con el vector de expresión de ADN de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 11 a 12;

b. se aísla e identifica dicho péptido diana extrayendo dicho péptido diana de dichas células hospedadoras transformadas; y

c. se purifica el péptido diana mediante el uso de las propiedades de afinidad para ligandos del polipéptido

de identificación. 30

14. Método de la reivindicación 13, en el que el péptido diana se aísla e identifica por inmunoprecipitación y Western blotting.

15. Método para purificar un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido de identificación de una cualquiera

de las reivindicaciones 1 a 4 y un péptido diana, en el que se usa una columna que comprende una matriz y un anticuerpo creado contra el dominio antigénico de uno cualquiera de los polipéptidos de identificación de las reivindicaciones 1 a 4.