Procedimiento para la purificación de una proteína a partir de una solución contaminada de la misma mediante cromatografía con proteína A,

en el que dicha proteína a purificar comprende una región CH2/CH3 fusionada a, o conjugada con un polipéptido seleccionado del grupo de renina; una hormona del crecimiento; factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona paratiroides; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; un factor de coagulación; un factor anti- coagulación; factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador del plasminógeno; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación); proteína inflamatoria de macrófago humana (MIP-1-alfa); una albúmina de suero; sustancia inhibidora Muelleriana, cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana; DNAsa, IgE; un antígeno citotóxico asociado a linfocito T (CTLA); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor para una hormona o un factor de crecimiento; proteína D; un factor reumatoide; un factor neurotrófico; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante (TGF); Factores I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) e (IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de crecimiento de tipo insulina; una proteína CD; eritropoyetina; un factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón; un factor estimulador de colonias (CSFs); una interleuquina; superóxido dismutasa; un receptor de células T; una proteína de membrana de superficie; un factor acelerador de la degradación; un antígeno viral; una proteína de transporte; un receptor "homing"; una adresina; una proteína reguladora; una integrina; un antígeno asociado a tumor; o un fragmento de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente; comprendiendo el método:

(a) adsorber la proteína en la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio;

(b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida mediante lavado de la fase sólida con un disolvente de electrolito hidrófobo, en donde el disolvente de electrolito hidrófobo comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y

(c) recuperar la proteína a partir de la fase sólida

Purificación por afinidad de polipéptido en una matriz de proteína.

Antecedentes de la invención

Esta invención está generalmente relacionada con la purificación de proteínas. En particular, la invención está relacionada con un procedimiento para purificar proteínas que contienen una región C_H2/C_H3, a través de cromatografía de afinidad con Proteína A.

La purificación económica de proteínas, a gran escala, se está convirtiendo en un problema de creciente importancia para la industria biotecnológica. Generalmente, las proteínas son producidas a través de cultivo celular, utilizando o bien líneas celulares bacterianas o de mamífero, diseñadas para producir la proteína de interés, por medio de la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, las mismas tienen que ser alimentadas con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores del crecimiento, suministrado habitualmente a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos proporcionada como alimento a las células y de los subproductos de las propias células hasta lograr un grado de pureza suficiente para un uso terapéutico constituye un desafío formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de residuos celulares dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Se puede lograr el que algunas proteínas sean secretadas directamente desde la célula en el medio de crecimiento del entorno; otras se obtienen intracelularmente. Para estas últimas, la primera etapa de un procedimiento de purificación conlleva la lisis de la célula, la cual puede ser efectuada a través de una diversidad de procedimientos, incluyendo la rotura mecánica, el shock osmótico o los tratamientos enzimáticos. La citada interrupción libera el contenido completo de la célula en el homogenado y, además, genera fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. Estos son generalmente eliminados a través de centrifugación diferencial o a través de filtración. El mismo problema surge, aunque a escala más pequeña, con las proteínas directamente secretadas, debido a la muerte natural de las células y a la liberación de proteínas de célula huésped intracelular en el transcurso del proceso de producción de la proteína.

Una vez se ha obtenido una solución clara que contiene la proteína de interés, su separación de las otras proteínas producidas por la célula es habitualmente intentada utilizando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan mezclas de proteínas en base a su carga, a su grado de hidrofobicidad o su tamaño. Para cada una de estas técnicas se dispone de diversas resinas cromatográficas, las cuales permiten la adaptación ajustada del esquema de purificación a la proteína involucrada en particular. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación reside en el hecho de que las proteínas pueden ser o bien desplazadas en sentido descendente, a diferentes velocidades, a lo largo de una columna larga, lográndose una separación física que se incrementa a medida que desciende adicionalmente por la columna, o bien adherirse selectivamente al medio de separación, siendo después eluidas diferencialmente a través de diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína seseada es separada de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna y la proteína de interés no lo hace, es decir, la proteína de interés está presente en el "eluido".

La cromatografía por afinidad, la cual explota una interacción específica entre la proteína que tiene que ser purificada y un agente de captura inmovilizado, puede constituir también una opción para algunas proteínas. La Proteína A en un adsorbente de utilidad para la cromatografía por afinidad de proteínas, tales como anticuerpos, que contienen una región Fc. La Proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD, procedente de Staphylococcus aureas, la cual se une con elevada afinidad (aproximadamente 10^-8 M para IgG humana) a la región Fc de anticuerpos.

Resumen de la invención

Un problema asociado a la cromatografía con Proteína A de preparaciones de proteínicas contaminadas ha sido identificado en el presente documento. En particular, se ha observado que en la cromatografía con Proteína A que utiliza una superficie de sílice o de vidrio para la adsorción de la Proteína A (por ejemplo, cuando la Proteína A es inmovilizada sobre una columna de vidrio de poro controlado o sobre una columna de ácido silícico), los contaminantes en la preparación proteínica (tal como proteínas de Ovario de Hámster Chino (CHOP), en la que la preparación proteínica procede de una célula CHO), se adhieren a la superficie de sílice o de vidrio de la fase sólida. Se observó que esto ocurría incluso cuando la fase sólida estaba revestida con un reactivo (tal como glicerol) en un intento por evitar la adherencia no específica a la misma. Para solucionar este problema en el presente caso, se ha pensado en una etapa de lavado intermedia. Esta etapa de lavado sirve para eliminar los contaminantes, pero no la Proteína A inmovilizada o la proteína de interés unida a la Proteína A, procedente de la fase sólida. En particular, se ha observado que en esta etapa de lavado intermedia pueden utilizarse electrolitos hidrófobos, cloruro de tetrametilamonio (TMAC), cloruro de tetraetilamonio (TEAC), cloruro de tetrapropilamonio y cloruro de tetrabutilamonio.

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para la purificación de una proteína a partir de una solución contaminada de la misma mediante cromatografía con proteína A, en el que dicha proteína a purificar comprende una región C_H2/C_H3 fusionada a, o conjugada con un polipéptido seleccionado del grupo de renina; una hormona del crecimiento; factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona paratiroides; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; un factor de coagulación; un factor anti-coagulación; factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador del plasminógeno; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación); proteína inflamatoria de macrófago humana (MIP-1-alfa); una albúmina de suero; sustancia inhibidora Muelleriana, cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana; DNAsa, IgE; un antígeno citotóxico asociado a linfocito T (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor para hormona o factor de crecimiento; o D; un factor reumatoide; un factor neurotrófico; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto; factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante (TGF); Factores I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) e (IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de crecimiento de tipo insulina; una proteína CD; eritropoyetina; un factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón; un factor estimulador de colonias (CSFs); una interleuquina; superóxido dismutasa; un receptor de células T; una proteína de membrana de superficie; un factor acelerador de la degradación; un antígeno viral; una proteína de transporte; un receptor "homing"; una adresina; una proteína reguladora; una integrina; un antígeno asociado a tumor; o un fragmento de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente; comprendiendo el método las siguientes etapas realizadas de manera secuencial: (a) adsorber la proteína en la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio; (b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida mediante lavado de la fase sólida con un disolvente de electrolito hidrófobo, en donde el disolvente de electrolito hidrófobo comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y...

1. Procedimiento para la purificación de una proteína a partir de una solución contaminada de la misma mediante cromatografía con proteína A, en el que dicha proteína a purificar comprende una región C_H2/C_H3 fusionada a, o conjugada con un polipéptido seleccionado del grupo de renina; una hormona del crecimiento; factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona paratiroides; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; un factor de coagulación; un factor anti- coagulación; factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador del plasminógeno; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación); proteína inflamatoria de macrófago humana (MIP-1-alfa); una albúmina de suero; sustancia inhibidora Muelleriana, cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana; DNAsa, IgE; un antígeno citotóxico asociado a linfocito T (CTLA); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor para una hormona o un factor de crecimiento; proteína D; un factor reumatoide; un factor neurotrófico; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante (TGF); Factores I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) e (IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de crecimiento de tipo insulina; una proteína CD; eritropoyetina; un factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón; un factor estimulador de colonias (CSFs); una interleuquina; superóxido dismutasa; un receptor de células T; una proteína de membrana de superficie; un factor acelerador de la degradación; un antígeno viral; una proteína de transporte; un receptor "homing"; una adresina; una proteína reguladora; una integrina; un antígeno asociado a tumor; o un fragmento de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente; comprendiendo el método:

(a) adsorber la proteína en la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio;

(b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida mediante lavado de la fase sólida con un disolvente de electrolito hidrófobo, en donde el disolvente de electrolito hidrófobo comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y

(c) recuperar la proteína a partir de la fase sólida.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o es un fragmento del mismo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un receptor para una hormona o un factor de crecimiento, o es un fragmento del mismo, y la hormona o el factor de crecimiento es VEGF.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una hormona de crecimiento seleccionada entre la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina, o es un fragmento de cualquiera de ellas.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un factor de coagulación seleccionado entre el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular, y el factor de von Willebrands, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un factor anticoagulación que es la proteína C, o un fragmento de la misma.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un activador de plasminógeno seleccionado entre uroquinasa, orina humana, y activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA), o es un fragmento de cualquiera de ellos.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una albúmina de suero que es una albúmina de suero humano, o es un fragmento de la misma.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una proteína microbiana que es beta-lactamasa, o es un fragmento de la misma.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un CTLA que es CTLA-4, o es un fragmento del mismo.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un factor neurotrófico seleccionado entre el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 ó -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ó NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el polipéptido es un factor de crecimiento nervioso que es NGF-ß, o es un fragmento del mismo.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un factor de crecimiento de fibroblasto que es aFGF o bFGF, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un TGF seleccionado entre TGF-alfa o TGF-beta, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el polipéptido es un TGF-beta seleccionado entre TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4, y TGF-ß5, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una proteína CD seleccionada entre CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20, o es un fragmento de cualquiera de ellas.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un interferón seleccionado entre interferón-alfa, -beta, y -gamma, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un CSF seleccionado entre M-CSF, GM-CSF y G-CSF, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

19. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una IL seleccionada entre cualquiera de IL-1 a IL-10, o es un fragmento de cualquiera de ellas.

20. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un antígeno viral que es una parte de la envoltura de VIH, o es un fragmento del mismo.

21. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una integrina seleccionada entre CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 y VCAM, o es un fragmento de cualquiera de ellas.

22. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un antígeno asociado a tumor seleccionado entre un receptor HER2, receptor HER3 y un receptor HER4, o es un fragmento de cualquiera de ellos.

23. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una columna de vidrio de poro controlado.

24. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una columna de ácido silícico.

25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los contaminantes son proteínas de ovario de hámster chino (CHOP).

26. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración del electrolito hidrófobo en el disolvente de electrolito hidrófobo se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 M.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que la concentración del electrolito hidrófobo en el disolvente de electrolito hidrófobo se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 M.

28. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el pH del disolvente de electrolito hidrófobo se encuentra en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que el pH del disolvente de electrolito hidrófobo se encuentra en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.

30. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende eluir la proteína utilizando un tampón de elución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,0.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la etapa (c) comprende eluir la proteína utilizando un tampón de elución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,5.