Purificación del factor XIII humano recombinante.

Método para la purificación del factor XIII a partir de un líquido biológico comprendiendo el paso de fraccionamiento del líquido biológico por cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC),

en el que antes del fraccionamiento por IMAC, el líquido biológico se fracciona por fraccionamiento de intercambio de aniones para producir una primera fracción enriquecida en el factor XIII y comprendiendo además el fraccionamiento de la primera fracción enriquecida en el factor XIII por fraccionamiento por interacción hidrofóbica antes del fraccionamiento por IMAC.

Purificación del factor XIII humano recombinante Antecedentes de la invención [0001] El factor XIII, también conocido como factor estabilizante de fibrina, fibrinoligasa, o transglutaminasa de plasma, es una glicoproteína de plasma que circula en la sangre como un zimógeno (Mr de aproximadamente 320 kDa) en complejo con fibrinógeno. (Greenberg and Shuman, J. Biol. Chem. 257:6096-6101 (1982) ) . El zimógeno de factor XIII de plasma es un tetrámero consistente en dos subunidades a y dos subunidades b. Cada subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 83, 000 Da, y la proteína completa tiene un peso molecular de aproximadamente 320 kDa. La subunidad a contiene el sitio catalítico de la enzima, mientras que la subunidad b está pensada para estabilizar la subunidad a o para regular la activación de factor XIII. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades a y b son conocidas. (Ichinose et al., Biochemistr y 25:6900-6906 (1986) ; Ichinose et al., Biochemistr y 25:4633-4638 (1986) ) . La expresión recombinante del factor XIII biológicamente activo ha sido descrito, ver por ejemplo, EP 0 268 772 B1.

In vivo, el factor XIII activado cataliza reacciones de reticulación entre otras moléculas de proteína. Durante las fases finales de coagulación sanguínea, la trombina convierte el zimógeno de factor XIII en una forma intermedia, que luego se disocia en presencia de iones de calcio para producir factor XIII activado. El factor XIII de placenta se activa con la escisión por trombina. El factor XIII activado es una transglutaminasa que cataliza la reticulación de polímeros de fibrina a través de la formación de enlaces de lisina º (a) -glutamil intermoleculares, aumentando así la resistencia del coágulo. Esta reacción de reticulación requiere la presencia de iones de calcio. El factor XIII activado cataliza también la reticulación de la a-cadena de fibrina para un inhibidor de a2-plasmina y fibronectina, al igual que la reticulación de colágeno y fibronectina, que puede estar relacionada con la cicatrización de heridas. La incorporación covalente del inhibidor de a2-plasmina en la red de fibrina puede aumentar la resistencia del coágulo para lisis.

La deficiencia del factor XIII se produce en "sangrado retardado", pero no afecta a la hemostasis primaria. Las prácticas de tratamiento corrientes para pacientes con deficiencias del factor XIII generalmente implican terapia de sustitución con factor XIII purificado aislado de fuentes naturales.

El factor XIII es también útil en el tratamiento de pacientes con esclerodermia (Delbarre et al., Lancet 2:204 (1984) ; Guillevin et al., Pharmatherapeutica 4:76-80 (1985) ; Grivaux and Pieron, Rev.Pnemnol. Clin. 43:102-103 (1987) ) , colitis ulcerativa (Suzuki and Takamura, Throm. Haemostas. 58:509 (1987) ; U.S. Patent No. 5.378.687) , colitis pseudomembranosa (Kuratsuji et al., Haemostasis 11:229-234 (1982) y como un profiláctico de resangrado en pacientes con hemorragia subaracnoidea (Henze et al., Thromb. Haemostas. 58:513 (1987) , además de otras condiciones. Además, el factor XIII ha demostrado ser útil como un componente de adhesivos de tejido (patentes estadounidenses número 4.414.976, 4.453.939, 4.377.572, 4.362.567, 4.298.598, 4.265.233 y patentes del Reino Unido nº 2 102 811 B) . Otro uso del factor XIII incluye reducir la pérdida de sangre en pacientes sometidos a cirugía (patente estadounidense nº 5.607.917) .

Métodos para la producción recombinante de factor XIII humano se conocen en la técnica. Ver por ejemplo, patente europea nº 0 268 772 B1. También se conocen métodos para la purificación del factor XIII a partir de fuentes biológicas que usan cristalización y/o pasos de precipitación combinados con ciertos métodos de cromatografía (patentes estadounidenses nº 4.597.899, 5.204.447 y 5.612.456) . En la patente estadounidense nº 5.612.456, se describen varios esquemas de purificación para el factor XIII: Chung and Folk (J. Biol. Chem. 247: 2798-2807, 1972) preparó el factor XIII de plasma concentrado de plaqueta o de una preparación fibrinógena; Cooke and Holbrook (Biochem. J. 141: 79-84, 1974) describen la purificación del factor XIII de la fracción Cohn-I, el método implica múltiples pasos de precipitación de sulfato amónico y fraccionamiento en la cromatografía de celulosa DEAE para purificar factor XIII de plasma; Skrzynia et al. (sangre 60: 1089-1095, 1985) purificada la subunidad a del factor XIII de un concentrado de placenta por cromatografía y precipitación de sulfato amónico; Zwisler et al. (patente estadounidense nº . 3.904.751) y Bohn et al. (patente estadounidense nº 3.931.399) describen procedimientos de aislamiento multifase que se basan en el uso de lactato de diamino-etoxi-acridina para precipitar el factor XIII; y Falke (U.S. Pat. No. 4.597.899) describe el aislamiento del factor XIII de un extracto de placenta por precipitación alcohólica. Aunque cada uno de los métodos previos resulta en el enriquecimiento del factor XIII, cada uno de los métodos es o complejo y/o costoso para el aislamiento del factor XIII a rendimiento elevado. Lo que se necesita en la técnica es un método más simple, menos costoso para el aislamiento del factor XIII altamente purificado, es decir, composiciones que tienen una pureza de más del 95% respecto a las proteínas contaminantes serían particularmente deseadas. Métodos que pueden proporcionar composiciones que comprenden factor XIII que es 1% o factor XIII menos activado, contienen menos del 2 % de agregados de proteína, y/o menos del 5 % de isómeros de carga de factor XIII, mientras proporcionan un rendimiento elevado también serían particularmente deseados.

Breve resumen de la invención [0006] La presente invención proporciona métodos para el aislamiento de factor XIII altamente purificado. En una forma de realización particular, usando los métodos descritos, puede obtenerse una composición de factor XIII que tiene una pureza de al menos 95 % respecto a proteínas contaminantes. Estos métodos están particularmente adaptados para la purificación de factor XIII recombinante de una célula huésped recombinante. En una forma de realización particular la célula huésped recombinante es una célula de levadura recombinante y los métodos proporcionan la purificación de factor XIII humano recombinante producido de levadura.

La presente invención proporciona métodos de purificación que no requieren una precipitación y/o un paso de cristalización. Los presentes métodos tampoco requieren el uso de anticuerpos costosos o anticuerpos monoclonales específicos para el factor XIII para la purificación del factor. Dentro de una forma de realización típica un líquido biológico que comprende cantidades recuperables de factor XIII se fracciona por cromatografía de afinidad por metal inmovilizado para producir un producto de factor XIII altamente concentrado que no contiene proteínas del líquido biológico que ha sido encontrado en el producto de factor XIII purificado por otros métodos de purificación típicos. En una forma de realización particular, el líquido biológico es un lisado de una célula de levadura recombinante transformado para producir factor XIII donde los métodos de la presente invención eliminan proteínas de levadura que típicamente se quedan con métodos de purificación previos.

En una forma de realización particular el líquido biológico primero es parcialmente purificado por fraccionamiento de intercambio de anión para producir una primera fracción enriquecida para factor XIII; esta primera fracción es posteriormente fraccionada por fraccionamiento de interacción hidrofóbica para producir una segunda fracción enriquecida para factor XIII; posteriormente la segunda fracción enriquecida es posteriormente fraccionada por cromatografía de afinidad por metal inmovilizado para producir una tercera fracción enriquecida para factor XIII. Esta tercera fracción puede ser opcionalmente adicionalmente fraccionada por fraccionamiento de intercambio de anión para producir un factor XIII altamente purificado con fracción de valor máximo.

El líquido biológico comprendiendo cantidades recuperables de factor XIII puede incluir sobrenadantes de cultivo celular, lisatos celulares, lisatos de célula clarificados, extractos celulares, extractos de tejido, sangre, plasma, y fracciones de las mismas. En una forma de realización típica de la presente invención el líquido biológico es un lisado celular, particularmente un lisado celular de una célula recombinante que ha sido creada genéticamente para producir factor XIII.

El factor XIII de la presente invención comprende cualquier factor XIII incluyendo... [Seguir leyendo]

1. Método para la purificación del factor XIII a partir de un líquido biológico comprendiendo el paso de fraccionamiento del líquido biológico por cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC) , en el que antes del fraccionamiento por IMAC, el líquido biológico se fracciona por fraccionamiento de intercambio de aniones para producir una primera fracción enriquecida en el factor XIII y comprendiendo además el fraccionamiento de la primera fracción enriquecida en el factor XIII por fraccionamiento por interacción hidrofóbica antes del fraccionamiento por IMAC.

2. Método según la reivindicación 1, comprendiendo además fraccionamiento de intercambio de aniones después del IMAC.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el líquido biológico es un lisado celular.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el lisado celular es un lisado de célula de levadura recombinante.

5. Método según la reivindicación 1, en el que el factor XIII es un factor XIII recombinante.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el factor XIII recombinante es factor XIII recombinante humano.

7. Método según la reivindicación 1, en el que el fraccionamiento de intercambio de aniones comprende el uso de un medio cromatográfico derivatizado con DEAE o QAE.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el fraccionamiento por interacción hidrofóbica comprende el uso de un medio cromatográfico derivatizado con fenilo, butilo o grupos de octilo.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el medio cromatográfico se derivatiza con grupos de fenilo.

10. Método según la reivindicación 1, en el que el fraccionamiento por cromatografía de afinidad por metal inmovilizado

2+2+ 2+

comprende el uso de un medio cromatográfico cargado con Cu Zn oNi .

2+

11. Método según la reivindicación 10, en el que el medio de cromatografía está cargado con Ni .