pTOP: Nuevo vector de expresión y purificación de proteínas.

La presente invención se refiere a (1) un nuevo vector de expresión génica que permite el marcaje,

la expresión y la purificación de proteínas, (2) al método de expresión y purificación proteica asociado a este vector y (3) a un kit que comprende dicho vector.

pTOP: NUEVO VECTOR DE EXPRESiÓN Y PURIFICACiÓN DE PROTEíNAS

La presente invención pertenece al campo de la Biología Molecular, la Genética y la Biotecnología. La presente invención se refiere a (1) un nuevo vector de expresión génica que permite el marcaje, la expresión y la purificación de proteínas, (2) al método de expresión y purificación proteica asociado a este vector y (3) a un kit que comprende dicho vector.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Existen en el mercado numerosos ejemplos de vectores de expresión, entre los que están los vectores pGEX de GE Healthcare Life Sciences o los vectores pBAD de Invitrogen. En estas dos series de vectores la clonación del gen de interés puede llevarse a cabo por restricción. Además, hay vectores pBAD comerciales preparados para clonar mediante el uso de topoisomerasa, o usando vectores donantes para recombinación con vectores pBAD de entrada mediante la tecnología de recombinación Gateway. Ambos sistemas permiten controlar la expresión del gen de interés gracias a dos operones, el operón lac (de lactosa) que se induce en presencia de lactosa o también de IPTG (isopropil-~-D-1-tiogalactopiranósido, un análogo de la lactosa pero más ventajoso porque sus niveles se mantienen debido a que no se degrada durante el cultivo celular) en cultivos de células transformadas con pGEX, y el operón ara (de arabinosa) que se induce mediante la adición de arabinosa en cultivos de células transformadas con pBAD. Además, ambos sistemas permiten el marcaje y la obtención de las proteínas con distintos marcadores, como son la fusión con la GST (Glutatión S-transferasa) , la tiorredoxina, una cadena de 6 histidinas, el epítopo V5 (la forma larga consta de 14 aminoácidos y la corta de 9 aminoácidos y derivan del epítopo Pk presente en las proteínas P y V del paramixovirus del virus 5 de simio (SV5) ) , o el epitopo myc (de 10 aminoácidos y es parte de la secuencia del factor de transcripción c-myc humano) , que facilitan tanto la detección como la purificación de la proteína expresada. Estos vectores también permiten el procesamiento de la proteína resultante con proteasas específicas para liberar así la proteína de interés, como la proteasa Pre-Scission (proteína de fusión de GST con la proteasa HRV 3C del rinovirus humano (HRV) tipo 14) , la proteasa Trombina (purificada de plasma bovino) o la proteasa Factor Xa (purificado de plasma bovino) , en el caso del vector pGEX, o la proteasa Enterokinasa (purificada de intestino bovino o usando la subunidad catalítica recombinante EKMax™ Enterokinase comercializada por Invitrogen) en el caso de pBAD.

Estos vectores permiten la obtención de la proteína de interés fusionada con un marcador o libre. Las proteínas fusionadas a los marcadores llevan, además de la correspondiente secuencia codificada por el ADN del gen de interés y de los marcadores, otros residuos aminoacídicos añadidos no pertenecientes a éstas, sino que son los codificados por las dianas de corte de las proteasas y por las dianas de restricción o los sitios de recombinación usados en la clonación. Aunque en menor número, tras liberación de las proteínas de interés por corte con las proteasas específicas, alguno de estos residuos permanece unido a su secuencia. Puesto que PreScission y Trombina solamente dejan 2 residuos después del corte, y Factor Xa y Enterokinasa cortan exactamente en el extremo C-terminal de su diana, la mayoría de los residuos remanentes después del corte se deben fundamentalmente a los codificados e introducidos por las secuencias de las dianas de restricción y/o de los sitios específicos necesarios para la clonación.

El vector p-CAL-n-FLAG de Stratagene es otro ejemplo de vector de expresión que permite la obtención de una proteína de fusión con distintos elementos, que consisten en el péptido CBP (del inglés "calmodulin-binding peptide" o péptido de unión a calmodulina) , la secuencia aminoacídica diana de la proteasa Trombina, el marcador FLAG (epítopo de 8 aminoácidos no natural diseñado específicamente como marcador de proteínas) y la secuencia aminoacídica diana de la proteasa Enterokinasa, situándose todos estos elementos en el extremo amino terminal de la proteína de interés. El gen de interés se clona por un método LlC ("Iigation independent cloning') , que a diferencia de otros métodos usados en la clonación en pGEX y en pBAD, evita la adición de resíduos extra provenientes de la etapa de clonación a la proteína de interés. Los elementos que presenta la proteína de fusión resultante de la expresión en el vector p-CAL-n-FLAG tienen distintas utilidades: el CBP permite la purificación por afinidad de la proteína de fusión en una resina de calmodulina. Por otro lado, el marcador FLAG es un epítopo reconocido por anticuerpos específicos, que permite también el atrapado de la proteína de fusión, bien para su purificación o por ejemplo para el estudio de interacciones proteína-proteína o proteína-ADN mediante inmunoprecipitación o inmunoprecipitación de cromatina. Es conveniente liberar la proteína así obtenida del marcador CBP mediante corte con la proteasa Trombina, ya que en este tipo de estudios de inmunoprecipitación la presencia del CBP puede ser contraproducente, pues puede unirse inespecíficamente a muchas proteínas celulares de unión a calmodulina, por lo que es conveniente quitarlo para obtener la proteína de interés fusionada únicamente al marcador FLAG y a la diana de la Enterokinasa.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un nuevo vector, llamado pTOP (Figuras 1 y 2) , para la expresión génica y purificación de proteínas basado en una secuencia nucleotídica que contiene diferentes elementos. Este vector permite el marcaje de la proteína de interés con distintas etiquetas o marcadores, que facilitan su manipulación y purificación, y permite también la obtención de la proteína de interés en distintas formas: fusionada con varios marcadores, con un único marcador o la proteína pura, sin ningún aminoácido extra (Figura 3) .

Más concretamente, el vector de expresión de la invención permite la obtención de una proteína de fusión con tres marcadores y dos secuencias diana de proteasas dispuestos de tal forma que la proteína de interés puede ser purificada fusionada con todos estos elementos, con un único marcador o simplemente la secuencia de la proteína de interés (Figura 3) , en una única etapa o en varias etapas de forma secuencial.

Los marcadores de la proteína de fusión que se obtiene gracias al vector de expresión de la invención presentan varias ventajas, como son que permiten la purificación de la proteína de fusión por afinidad en distintos tipos de sistemas, lo cual aumenta la versatilidad del método de purificación y lo hace por tanto más eficiente. La proteína de fusión lleva la GST y, por tanto, puede ser purificada mediante afinidad por glutatión o mediante inmunoprecipitación, ya que hay anticuerpos específicos contra GST. Además, la proteína de fusión lleva dos epítopos polihistidina, lo cual permite su purificación mediante afinidad por metales como el níquel o el cobalto, o mediante inmunoprecipitación, ya que hay anticuerpos específicos contra epítopos polihistidina. El hecho de que la proteína lleve dos epítopos polihistidina en lugar de uno, como ocurre en otros casos del estado de la técnica, permite que la purificación sea más eficiente, ya que la proteína se une con más afinidad al metal y esto permite que se puedan realizar más lavados y de mayor astringencia para eliminar selectivamente otras proteínas celulares no deseadas que también presentan afinidad por el metal.

Otra ventaja de la proteína de fusión obtenida mediante el vector pTOP de expresión de la invención es que puede ser purificada de distintas formas y en etapas sucesivas, como podría ser una primera purificación de la proteína de fusión conteniendo todos los elementos en una columna de níquel y elución con imidazol, una segunda purificación en una columna de glutatión, que puede ir seguida del procesamiento de la proteína con la proteasa PreScission para liberarla de la GST y de la primera polihistidina y, a continuación, una tercera purificación por afinidad mediante anticuerpos contra la segunda polihistidina.

El vector del primer aspecto de la invención presenta además la ventaja de que comprende un elemento que permite el control de la expresión de la proteína de interés mediante la adición de una sustancia, es decir, presenta un promotor... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia nucleotídica que comprende los siguientes elementos:

a. un codón de iniciación,

b. una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador M,

c. una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador N,

d. una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica P de reconocimiento de una proteasa,

e. una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador 0,

f. una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica Q de reconocimiento de una proteasa,

g. un codón de terminación.

2. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior que comprende una secuencia que consiste esencialmente en los siguientes elementos:

a. un codón de iniciación,

b. una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador M,

c. una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador N,

d. una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica P de reconocimiento de una proteasa,

e. una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador 0,

f. una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica Q de reconocimiento de una proteasa,

g. un codón de terminación.

3. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende los elementos en el siguiente orden: un codón de iniciación, una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador M, una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador N, una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica P de reconocimiento de una proteasa, una secuencia nucleotídica que codifica para un marcador O, una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica Q de reconocimiento de una proteasa, un codón de terminación.

4. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque los marcadores M y O son iguales.

5. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque los marcadores M, N Y O se seleccionan de la lista que comprende: polihistidina, Glutatión S-transferasa, avidina, estreptavidina, hemaglutinina, VSV-G, HSVtk, FLAG, proteína de unión a maltosa, V5, myc y una proteína fluorescente.

6. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde los marcadores M, N Y O se seleccionan de entre polihistidina y Glutatión Stransferasa.

7. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde los marcadores M y O son una polihistidina y el marcador N es la Glutatión Stransferasa.

8. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde los marcadores M y O son una polihistidina de entre 6 y 14 histidinas, preferiblemente de 10 histidinas.

9. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque las secuencias aminoacídicas P y Q de reconocimiento de proteasas se seleccionan de la lista que comprende las dianas de las proteasas: Pre-Scission, Enterokinasa, Trombina, Tev, HRV 3C, ULP1 y factor Xa.

10. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde la secuencia aminoacídica P es la diana de reconocimiento de la proteasa PreScission y la secuencia aminoacídica Q es la diana de reconocimiento de la proteasa Enterokinasa.

11. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende un promotor inducible.

12. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde el promotor inducible se selecciona de la lista que comprende: promotor inducible por arabinosa, promotor inducible por lactosa o IPTG (isopropil-~-Dtiogalactósido) , promotor inducible por ecdisona, promotor inducible por tetraciclina, promotor inducible por galactosa, promotor inducible por metales pesados, promotor inducible por mifepristona, promotor inducible por triptófano, promotor inducible por temperatura, promotor inducible por fosfatos y promotor inducible por metanol.

13. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde el promotor es inducible por arabinosa.

14. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende al menos un origen de replicación.

15. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior que comprende el origen de replicación del plásmido pUCo

16. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende al menos un gen de selección.

17. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde el gen de selección se escoge de la lista que comprende: un gen de resistencia a antibiótico, un gen que codifica para una proteína fluorescente, un gen que codifica para una proteína luminiscente, un gen que codifica para la betagalactosidasa y un gen que convierte a cepas auxótrofas en protótrofas.

18. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde el gen de selección es un gen de resistencia a antibiótico.

19. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde el gen de selección es un gen de resistencia a ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, geneticina, higromicina B, puromicina, blasticidina, metotrexato o zeocina.

20. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior donde el gen de selección es un gen de resistencia a ampicilina.

21. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque es SEQ ID NO: 1 o una variante bioequivalente.

22. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque es una construcción génica o forma parte de una construcción génica.

23. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior caracterizada porque es una construcción génica.

24. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores caracterizada porque es un vector o forma parte de un vector.

25. La secuencia nucleotídica según la reivindicación anterior caracterizada porque es un vector.

26. Un método de expresión génica y purificación proteica caracterizado porque comprende una etapa (h) :

h. Clonar un gen de interés en una secuencia nucleotídica, construcción génica o vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

27. El método según la reivindicación anterior caracterizado porque después de la etapa (h) se lleva a cabo la siguiente etapa (i) :

i. Producir la proteína codificada por la secuencia clonada en la etapa (h) .

28. El método según la reivindicación anterior caracterizado porque la etapa (i) comprende al menos dos subetapas:

i'. Introducir la secuencia nucleotídica, construcción génica o vector

obtenido en la etapa (h) en una célula procariota o en una célula

eucariota,

i". Cultivar la célula de la etapa (i') en presencia de las sustancias

necesarias para que se exprese la proteína codificada por el gen de

interés clonado en la etapa (h) .

29. El método según la reivindicación anterior donde en la etapa (i') se introduce la secuencia nucleotídica, construcción génica o vector en una célula procariota, preferiblemente Eseheriehia eoli.

30. El método según la reivindicación 28 caracterizado porque en la etapa (i') se introduce la secuencia nucleotídica, construcción génica o vector en una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero.

31. El método según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores donde el cultivo del paso (i ") se hace en presencia de arabinosa.

32. El método según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, que además comprende la siguiente etapa (j) :

j. Purificar la proteína producida en la etapa (i) .

33. El método según la reivindicación anterior caracterizado porque la etapa U) comprende al menos tres subetapas:

j'. Lisar las células cultivadas en la etapa (i") .

j". Unir la proteína del lisado obtenido en la etapa (j') a un ligando

inmovilizado en un soporte sólido.

j"'. Liberar la proteína de su unión al ligando de la etapa U") .

34. El método según la reivindicación anterior donde el ligando inmovilizado en un soporte sólido de la etapa U") es Glutatión.

35. El método según la reivindicación 33 donde el ligando inmovilizado en un soporte sólido de la etapa (j") es un ión metálico.

36. El método según la reivindicación anterior donde el ión metálico es níquel

(11) y/o cobalto (11) .

37. El método según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores donde la proteína se libera de su unión al ligando mediante al menos una de las siguientes formas: un cambio en el pH, la adición de ligando libre, la adición de una molécula que desplace a la proteína mediante competición por la unión al ligando, el tratamiento con un agente reductor, el procesamiento con una proteasa.

38. El método según la reivindicación anterior donde la proteína se libera de su unión al ligando mediante el procesamiento con una proteasa.

39. El método según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde la proteasa se selecciona de la lista que comprende: Pre-Scission, Enterokinasa, Trombina, Tev, HRV 3C, ULP1 y factor Xa.

40. El método según la reivindicación anterior que comprende la proteasa PreScission.

41. El método según la reivindicación 39 que comprende la proteasa Enterokinasa.

42. El método según la reivindicación 37 donde la molécula que compite por la unión al ligando es imidazol.

43. El método según la reivindicación 37 donde el agente reductor es glutatión reducido.

44. Un kit que comprende una secuencia nucleotídica, una construcción génica

o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para la expresión y purificación proteica.

45. El kit según la reivindicación anterior donde el vector es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 o una variante bioequivalente.

46. El kit según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde el vector es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1.

47. El kit según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores que además comprende las instrucciones para llevar a cabo los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 43.

48. El kit según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores que además comprende al menos una proteasa.

49. El kit según la reivindicación anterior donde la proteasa es Pre-Scission.

50. El kit según la reivindicación 48 donde la proteasa es Enterokinasa.

51. El kit según cualquiera de las siete reivindicaciones anteriores que comprende una pareja de cebadores directo y reverso de entre 30 y 100 nucleótidos, donde la secuencia del cebador directo coincide con el fragmento de SEO ID NO: 1 y cuyo extremo 3' es el nucleótido en la posición 1.093 de SEO ID NO: 1, Y donde la secuencia del cebador reverso es complementaria a SEO ID NO: 1 de manera que su extremo 3' es el nucleótido complementario al nucleótido en la posición 1.094 de SEO ID NO: 1.

FIG.1

BarnHI

ATG

líOHEg, Wml:

J, .... -Bglll

MD

BarnHI ~~ BgllI

I ATG IlOHEg, RW:

:·······'····'··················1:::::~§:::t

R

Nhel Bglll Nhel

I-A;, .., ;;.;.T...;;...G~:t::;;:;:QH~.:::::::::I;·......~i........._Il!I:

CiPCR

r-

BgllI Nhel

CiPCR

B~t¡" ~.., mllllH1

pPreTOPl

4731 bp

pPreTOP2

4734 bp

pPreTOP3

4764 bp

pPreTOP4

5421 bp

pTOP

5460 bp

FIG.2

pTOP

4854 bp

FIG.3

Protefna

FIG.4

A

o 1 2 3 4 S ti

B

leDa

58 48

36, , 526 -

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidade de Santiago de Compostela

<120> pTOP: Nuevo vector de expresión y purificación de proteínas

<130> 1596.30

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4854

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Vector pTOP

<400> 1 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tgggccacca ccatcaccac caccatcatc atcatggcgg 360 cagatcttcc cctatactag gttattggaa aattaagggc cttgtgcaac ccactcgact 420 tcttttggaa tatcttgaag aaaaatatga agagcatttg tatgagcgcg atgaaggtga 480 taaatggcga aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat 540 tgatggtgat gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca 600 caacatgttg ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt 660 tttggatatt agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa 720 agttgatttt cttagcaagc tacctgaaat gctgaaaatg ttcgaagatc gtttatgtca 780 taaaacatat ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct 840 tgatgttgtt ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt 900 taaaaaacgt attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat 960 agcatggcct ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaatc 1020 ggatctggaa gttctgttcc aggggcccca tcaccatcac catcaccatc accatcacga 1080 tgacgatgac aagtaaggaa gacggagttg tcattggaat tcgaagcttg ggcccgaaca 1140 aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg 1200 agtttaaacg gtctccagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 1260 cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 1320 gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 1380 agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 1440 tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 1500 taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 1560 ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 1620 tggccttttt gcgtttctac aaactctttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 1680 tatccgctca 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gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 2580 tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 2640 ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 2700 accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 2760 aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 2820 ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 2880 gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 2940 ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 3000 ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 3060 ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 3120 gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 3180 cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 3240 cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 3300 cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 3360 aacgccagca 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caagcaaaca tgctgtgcga cgctggcgat atcaaaattg ctgtctgcca 4260 ggtgatcgct gatgtactga caagcctcgc gtacccgatt atccatcggt ggatggagcg 4320 actcgttaat cgcttccatg cgccgcagta acaattgctc aagcagattt atcgccagca 4380 gctccgaata gcgcccttcc ccttgcccgg cgttaatgat ttgcccaaac aggtcgctga 4440 aatgcggctg gtgcgcttca tccgggcgaa agaaccccgt attggcaaat attgacggcc 4500 agttaagcca ttcatgccag taggcgcgcg gacgaaagta aacccactgg tgataccatt 4560 cgcgagcctc cggatgacga ccgtagtgat gaatctctcc tggcgggaac agcaaaatat 4620 cacccggtcg gcaaacaaat tctcgtccct gatttttcac caccccctga ccgcgaatgg 4680 tgagattgag aatataacct ttcattccca gcggtcggtc gataaaaaaa tcgagataac 4740 cgttggcctc aatcggcgtt aaacccgcca ccagatgggc attaaacgag tatcccggca 4800 gcaggggatc attttgcgct tcagccatac ttttcatact cccgccattc agag 4854

<210> 2

<211> 4731

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Secuencia del plásmido ppreTOPI-Tfam

<400> 2 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tgggccacca ccatcaccac caccatcatc atcatggcgg 360

atccttttcc agcatgggta gctatccaaa gaaacctatg agttcatacc ttcgattttc 420 cacagaacag ctacccaaat ttaaagctaa acacccagat gcaaaacttt cagaattggt 480 taggaaaatt gcagccctgt ggagggagct accagaagca gaaaaaaagg tttatgaagc 540 tgattttaaa gctgagtgga aagcatacaa agaagctgtg agcaagtata aagagcagct 600 aactccaagt cagctgatgg gtatggagaa ggaggcccgg cagagacggt taaaaaagaa 660 agcactggta aagagaagag aattaatttt gcttggaaaa ccaaaaagac ctcgttcagc 720 atataacatt tatgtatctg aaagcttcca ggaggcaaag gatgattcgg ctcagggaaa 780 attgaagctt gtaaatgagg cttggaaaaa tctgtctcct gaggaaaagc aggcatatat 840 tcagcttgct aaagatgata ggattcgtta cgacaatgaa atgaagtctt gggaagagca 900 gatggctgaa gttggacgaa gtgatctcat ccgtcgaagt gtgaaacgat ccggagacat 960 ctctgagcat taaggaagac ggagttgtca ttggaattcg aagcttgggc ccgaacaaaa 1020 actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc cgtcgaccat catcatcatc atcattgagt 1080 ttaaacggtc tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 1140 attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 1200 gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 1260 gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 1320 gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 1380 gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc 1440 aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc tgacggatgg 1500 cctttttgcg tttctacaaa ctctttttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 1560 ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 1620 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 1680 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 1740 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 1800 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 1860 gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 1920 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 1980 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 2040 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 2100 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 2160 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 2220 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 2280 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 2340 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 2400 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 2460 ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 2520 aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 2580 aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 2640 ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 2700 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 2760 actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 2820 caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 2880 gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 2940 ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 3000 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 3060 cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 3120 acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 3180 ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 3240 gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 3300 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 3360 accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 3420 cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc 3480 actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc 3540 tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 3600 gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 3660 tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagcagatc aattcgcgcg 3720 cgaaggcgaa gcggcatgca taatgtgcct gtcaaatgga cgaagcaggg attctgcaaa 3780 ccctatgcta ctccgtcaag ccgtcaattg tctgattcgt taccaattat gacaacttga 3840 cggctacatc attcactttt tcttcacaac cggcacggaa ctcgctcggg ctggccccgg 3900 tgcatttttt aaatacccgc gagaaataga gttgatcgtc aaaaccaaca ttgcgaccga 3960 cggtggcgat aggcatccgg gtggtgctca aaagcagctt cgcctggctg atacgttggt 4020 cctcgcgcca gcttaagacg ctaatcccta actgctggcg gaaaagatgt gacagacgcg 4080 acggcgacaa gcaaacatgc tgtgcgacgc tggcgatatc aaaattgctg tctgccaggt 4140 gatcgctgat gtactgacaa gcctcgcgta cccgattatc catcggtgga tggagcgact 4200 cgttaatcgc ttccatgcgc cgcagtaaca attgctcaag cagatttatc gccagcagct 4260 ccgaatagcg cccttcccct tgcccggcgt taatgatttg cccaaacagg tcgctgaaat 4320 gcggctggtg cgcttcatcc gggcgaaaga accccgtatt ggcaaatatt gacggccagt 4380 taagccattc atgccagtag gcgcgcggac gaaagtaaac ccactggtga taccattcgc 4440

gagcctccgg atgacgaccg tagtgatgaa tctctcctgg cgggaacagc aaaatatcac 4500 ccggtcggca aacaaattct cgtccctgat ttttcaccac cccctgaccg cgaatggtga 4560 gattgagaat ataacctttc attcccagcg gtcggtcgat aaaaaaatcg agataaccgt 4620 tggcctcaat cggcgttaaa cccgccacca gatgggcatt aaacgagtat cccggcagca 4680 ggggatcatt ttgcgcttca gccatacttt tcatactccc gccattcaga 9 4731

<210> 3

<211> 4734

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Secuencia de ppreTOP2-TFAM

<400> 3 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tgggccacca ccatcaccac caccatcatc atcatggcgg 360 cagatctttt tccagcatgg gtagctatcc aaagaaacct atgagttcat accttcgatt 420 ttccacagaa cagctaccca aatttaaagc taaacaccca gatgcaaaac tttcagaatt 480 ggttaggaaa attgcagccc tgtggaggga gctaccagaa gcagaaaaaa aggtttatga 540 agctgatttt aaagctgagt ggaaagcata caaagaagct gtgagcaagt ataaagagca 600 gctaactcca agtcagctga tgggtatgga gaaggaggcc cggcagagac ggttaaaaaa 660 gaaagcactg gtaaagagaa gagaattaat tttgcttgga aaaccaaaaa gacctcgttc 720 agcatataac atttatgtat ctgaaagctt ccaggaggca aaggatgatt cggctcaggg 780 aaaattgaag cttgtaaatg aggcttggaa aaatctgtct cctgaggaaa agcaggcata 840 tattcagctt gctaaagatg ataggattcg ttacgacaat gaaatgaagt cttgggaaga 900 gcagatggct gaagttggac gaagtgatct catccgtcga agtgtgaaac gatccggaga 960 catctctgag cattaaggaa gacggagttg tcattggaat tcgaagcttg ggcccgaaca 1020 aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg 1080 agtttaaacg gtctccagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 1140 cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 1200 gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 1260 agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 1320 tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 1380 taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 1440 ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 1500 tggccttttt gcgtttctac aaactctttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 1560 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 1620 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 1680 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 1740 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 1800 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 1860 cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 1920 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 1980 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 2040 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 2100 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 2160 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 2220 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 2280 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 2340 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 2400 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 2460 tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 2520 ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 2580 accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 2640 aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 2700 ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 2760 gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 2820 ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 2880 ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 2940 ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 3000 gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 3060 cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 3120 cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 3180 cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 3240 aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 3300 ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 3360 gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 3420 gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg 3480 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 3540 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 3600 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 3660 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc 3720 gcgcgaaggc gaagcggcat gcataatgtg cctgtcaaat ggacgaagca gggattctgc 3780 aaaccctatg ctactccgtc aagccgtcaa ttgtctgatt cgttaccaat tatgacaact 3840 tgacggctac atcattcact ttttcttcac aaccggcacg gaactcgctc gggctggccc 3900 cggtgcattt tttaaatacc cgcgagaaat agagttgatc gtcaaaacca acattgcgac 3960 cgacggtggc gataggcatc cgggtggtgc tcaaaagcag cttcgcctgg ctgatacgtt 4020 ggtcctcgcg ccagcttaag acgctaatcc ctaactgctg gcggaaaaga tgtgacagac 4080 gcgacggcga caagcaaaca tgctgtgcga cgctggcgat atcaaaattg ctgtctgcca 4140 ggtgatcgct gatgtactga caagcctcgc gtacccgatt atccatcggt ggatggagcg 4200 actcgttaat cgcttccatg cgccgcagta acaattgctc aagcagattt atcgccagca 4260 gctccgaata gcgcccttcc ccttgcccgg cgttaatgat ttgcccaaac aggtcgctga 4320 aatgcggctg gtgcgcttca tccgggcgaa agaaccccgt attggcaaat attgacggcc 4380 agttaagcca ttcatgccag taggcgcgcg gacgaaagta aacccactgg tgataccatt 4440 cgcgagcctc cggatgacga ccgtagtgat gaatctctcc tggcgggaac agcaaaatat 4500 cacccggtcg gcaaacaaat tctcgtccct gatttttcac caccccctga ccgcgaatgg 4560 tgagattgag aatataacct ttcattccca gcggtcggtc gataaaaaaa tcgagataac 4620 cgttggcctc aatcggcgtt aaacccgcca ccagatgggc attaaacgag tatcccggca 4680 gcaggggatc attttgcgct tcagccatac ttttcatact cccgccattc agag 4734

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Cebador directo para la clonación de la diana de de pre-Scission en pPRETOP2-Tfam que contiene las dianas de Bgl II Y NheI

<400> 4 ttttagatct ctggaagttc tgttccaggg gcccgctagc ttttccagca tgggtagcta 60

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Cebador inverso para la clonación de la diana de pre-Scission en pPRETOP2-Tfam

<400> 5 catacccatc agctgacttg gagttag 27

<210> 6

<211> 4764

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Secuencia del plásmido ppreTOP3-Tfam

<400> 6 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tgggccacca ccatcaccac caccatcatc atcatggcgg 360 cagatctctg gaagttctgt tccaggggcc cgctagcttt tccagcatgg gtagctatcc 420 aaagaaacct atgagttcat accttcgatt ttccacagaa cagctaccca aatttaaagc 480 taaacaccca gatgcaaaac tttcagaatt ggttaggaaa attgcagccc tgtggaggga 540 gctaccagaa gcagaaaaaa aggtttatga agctgatttt aaagctgagt ggaaagcata 600 caaagaagct gtgagcaagt ataaagagca gctaactcca agtcagctga tgggtatgga 660 gaaggaggcc cggcagagac ggttaaaaaa gaaagcactg gtaaagagaa gagaattaat 720 tttgcttgga aaaccaaaaa gacctcgttc agcatataac atttatgtat ctgaaagctt 780 ccaggaggca aaggatgatt cggctcaggg aaaattgaag cttgtaaatg aggcttggaa 840 aaatctgtct cctgaggaaa agcaggcata tattcagctt gctaaagatg ataggattcg 900 ttacgacaat gaaatgaagt cttgggaaga gcagatggct gaagttggac gaagtgatct 960 catccgtcga agtgtgaaac gatccggaga catctctgag cattaaggaa gacggagttg 1020 tcattggaat tcgaagcttg ggcccgaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag 1080 cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg agtttaaacg gtctccagct tggctgtttt 1140 ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg 1200 ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 1260 tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg 1320 aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 1380 ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa 1440 cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca 1500 tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttt 1560 tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 1620 atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 1680 attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1740 gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1800 agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 1860 aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 1920 cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 1980 cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 2040 actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 2100 cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 2160 ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 2220 ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 2280 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 2340 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 2400 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 2460 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 2520 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 2580 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 2640 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 2700 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 2760 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 2820 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 2880 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 2940 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 3000 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 3060 ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 3120 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 3180 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 3240 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 3300 ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 3360 gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 3420 cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3480 catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3540 gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 3600 gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 3660 acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 3720 cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc gcgcgaaggc gaagcggcat gcataatgtg 3780 cctgtcaaat ggacgaagca gggattctgc aaaccctatg ctactccgtc aagccgtcaa 3840 ttgtctgatt cgttaccaat tatgacaact tgacggctac atcattcact ttttcttcac 3900 aaccggcacg gaactcgctc gggctggccc cggtgcattt tttaaatacc cgcgagaaat 3960 agagttgatc gtcaaaacca acattgcgac cgacggtggc gataggcatc cgggtggtgc 4020 tcaaaagcag cttcgcctgg ctgatacgtt ggtcctcgcg ccagcttaag acgctaatcc 4080 ctaactgctg gcggaaaaga tgtgacagac gcgacggcga caagcaaaca tgctgtgcga 4140 cgctggcgat atcaaaattg ctgtctgcca ggtgatcgct gatgtactga caagcctcgc 4200 gtacccgatt atccatcggt ggatggagcg actcgttaat cgcttccatg cgccgcagta 4260 acaattgctc aagcagattt atcgccagca gctccgaata gcgcccttcc ccttgcccgg 4320 cgttaatgat ttgcccaaac aggtcgctga aatgcggctg gtgcgcttca tccgggcgaa 4380 agaaccccgt attggcaaat attgacggcc agttaagcca ttcatgccag taggcgcgcg 4440 gacgaaagta aacccactgg tgataccatt cgcgagcctc cggatgacga ccgtagtgat 4500 gaatctctcc tggcgggaac agcaaaatat cacccggtcg gcaaacaaat tctcgtccct 4560 gatttttcac caccccctga ccgcgaatgg tgagattgag aatataacct ttcattccca 4620 gcggtcggtc gataaaaaaa tcgagataac cgttggcctc aatcggcgtt aaacccgcca 4680 ccagatgggc attaaacgag tatcccggca gcaggggatc attttgcgct tcagccatac 4740 ttttcatact cccgccattc agag 4764

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador directo para la clonación de la secuencia que codifica para la GST en pPRETOP3-Tfam

<400> 7 catcatcatg gcggcagatc ttcccctata ctagg 35

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador inverso para la clonación de la secuencia que codifica para la GST en pPRETOP3-Tfam

<400> 8 aaagctagcg ggcccctgga acagaacttc 30

<210> 9

<211> 5421

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> <223> Secuencia del plásmido ppreTOP4-Tfam

<400> 9 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tgggccacca ccatcaccac caccatcatc atcatggcgg 360 cagatcttcc cctatactag gttattggaa aattaagggc cttgtgcaac ccactcgact 420 tcttttggaa tatcttgaag aaaaatatga agagcatttg tatgagcgcg atgaaggtga 480 taaatggcga aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat 540 tgatggtgat gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca 600 caacatgttg ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt 660 tttggatatt agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa 720 agttgatttt cttagcaagc tacctgaaat gctgaaaatg ttcgaagatc gtttatgtca 780 taaaacatat ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct 840 tgatgttgtt ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt 900 taaaaaacgt attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat 960 agcatggcct ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaatc 1020 ggatctggaa gttctgttcc aggggcccgc tagcttttcc agcatgggta gctatccaaa 1080 gaaacctatg agttcatacc ttcgattttc cacagaacag ctacccaaat ttaaagctaa 1140 acacccagat gcaaaacttt cagaattggt taggaaaatt gcagccctgt ggagggagct 1200 accagaagca gaaaaaaagg tttatgaagc tgattttaaa gctgagtgga aagcatacaa 1260 agaagctgtg agcaagtata aagagcagct aactccaagt cagctgatgg gtatggagaa 1320 ggaggcccgg cagagacggt taaaaaagaa agcactggta aagagaagag aattaatttt 1380 gcttggaaaa ccaaaaagac ctcgttcagc atataacatt tatgtatctg aaagcttcca 1440 ggaggcaaag gatgattcgg ctcagggaaa attgaagctt gtaaatgagg cttggaaaaa 1500 tctgtctcct gaggaaaagc aggcatatat tcagcttgct aaagatgata ggattcgtta 1560 cgacaatgaa atgaagtctt gggaagagca gatggctgaa gttggacgaa gtgatctcat 1620 ccgtcgaagt gtgaaacgat ccggagacat ctctgagcat taaggaagac ggagttgtca 1680 ttggaattcg aagcttgggc ccgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc 1740 cgtcgaccat catcatcatc atcattgagt ttaaacggtc tccagcttgg ctgttttggc 1800 ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata 1860 aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca 1920 gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac 1980 tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg 2040 ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt 2100 tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca 2160 aattaagcag aaggccatcc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa ctctttttgt 2220 ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 2280 cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 2340 cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 2400 aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 2460 ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 2520 gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 2580 cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 2640 acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 2700 gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 2760 aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 2820 ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 2880 ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 2940 gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 3000 aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 3060 aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 3120 aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 3180 gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 3240 gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 3300 tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 3360 gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 3420 caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 3480 actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 3540 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 3600 cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 3660 gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 3720 cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 3780 gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 3840 tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 3900 tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 3960 gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 4020 aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 4080 agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 4140 ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 4200 tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac 4260 acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 4320 gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 4380 aacgcgcgag gcagcagatc aattcgcgcg cgaaggcgaa gcggcatgca taatgtgcct 4440 gtcaaatgga cgaagcaggg attctgcaaa ccctatgcta ctccgtcaag ccgtcaattg 4500 tctgattcgt taccaattat gacaacttga cggctacatc attcactttt tcttcacaac 4560 cggcacggaa ctcgctcggg ctggccccgg tgcatttttt aaatacccgc gagaaataga 4620 gttgatcgtc aaaaccaaca ttgcgaccga cggtggcgat aggcatccgg gtggtgctca 4680 aaagcagctt cgcctggctg atacgttggt cctcgcgcca gcttaagacg ctaatcccta 4740 actgctggcg gaaaagatgt gacagacgcg acggcgacaa gcaaacatgc tgtgcgacgc 4800 tggcgatatc aaaattgctg tctgccaggt gatcgctgat gtactgacaa gcctcgcgta 4860 cccgattatc catcggtgga tggagcgact cgttaatcgc ttccatgcgc cgcagtaaca 4920 attgctcaag cagatttatc gccagcagct ccgaatagcg cccttcccct tgcccggcgt 4980 taatgatttg cccaaacagg tcgctgaaat gcggctggtg cgcttcatcc gggcgaaaga 5040 accccgtatt ggcaaatatt gacggccagt taagccattc atgccagtag gcgcgcggac 5100 gaaagtaaac ccactggtga taccattcgc gagcctccgg atgacgaccg tagtgatgaa 5160 tctctcctgg cgggaacagc aaaatatcac ccggtcggca aacaaattct cgtccctgat 5220 ttttcaccac cccctgaccg cgaatggtga gattgagaat ataacctttc attcccagcg 5280 gtcggtcgat aaaaaaatcg agataaccgt tggcctcaat cggcgttaaa cccgccacca 5340 gatgggcatt aaacgagtat cccggcagca ggggatcatt ttgcgcttca gccatacttt 5400 tcatactccc gccattcaga 9 5421

<210> 10

<211> 90

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Cebador directo con la secuencia que codifica para 10 histidinas y para la diana de corte de la enterokinasa

<400> 10 gaagttctgt tccaggggcc ccatcaccat caccatcacc atcaccatca cgatgacgat 60

gacaagtttt ccagcatggg tagctatcca 90

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador inverso que hibrida con la secuencia que codifica para la diana de corte de pre-Scission

<400> 11 aaagctagcg ggcccctgga acagaacttc 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador directo para distinguir pPRETOP4-Tfam de pTOP-Tfam

<400> 12 ctaggctgga agttctgttc caggggcccg 30

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador inverso para distinguir pPRETOP4-Tfam de pTOP-Tfam

<400> 13 ttttgaattc ctctttatac ttgctcacag cttcttt 37

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador directo para comprobar el vector pTOP-Tfam

<400> 14 gaccaaagcc atgacaaaaa cg 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador inverso para comprobar el vector pTOP-Tfam

<400> 15 tcgacggcgc tattcagatc 20

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador directo de clonación de PCBP1 en pTOP

<400> 16 cacgatgacg atgacaagga tgccggtgtg actgaa 36

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Cebador inverso de clonación de PCBP1 en pTOP

<400> 17 atgacaactc cgtcttccct agctgcaccc cat 33

<210> 18

<211> 5918

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Secuencia de pTOP-PCBP1

<400> 18 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300 taacaggagg aattaaccat gggccaccac catcaccacc accatcatca tcatggcggc 360 agatcttccc ctatactagg ttattggaaa attaagggcc ttgtgcaacc cactcgactt 420 cttttggaat atcttgaaga aaaatatgaa gagcatttgt atgagcgcga tgaaggtgat 480 aaatggcgaa acaaaaagtt tgaattgggt ttggagtttc ccaatcttcc ttattatatt 540 gatggtgatg ttaaattaac acagtctatg gccatcatac gttatatagc tgacaagcac 600 aacatgttgg gtggttgtcc aaaagagcgt gcagagattt caatgcttga aggagcggtt 660 ttggatatta gatacggtgt ttcgagaatt gcatatagta aagactttga aactctcaaa 720 gttgattttc ttagcaagct acctgaaatg ctgaaaatgt tcgaagatcg tttatgtcat 780 aaaacatatt taaatggtga tcatgtaacc catcctgact tcatgttgta tgacgctctt 840 gatgttgttt tatacatgga cccaatgtgc ctggatgcgt tcccaaaatt agtttgtttt 900 aaaaaacgta ttgaagctat cccacaaatt gataagtact tgaaatccag caagtatata 960 gcatggcctt tgcagggctg gcaagccacg tttggtggtg gcgaccatcc tccaaaatcg 1020 gatctggaag ttctgttcca ggggccccat caccatcacc atcaccatca ccatcacgat 1080 gacgatgaca aggatgccgg tgtgactgaa agtggactaa atgtgactct caccattcgg 1140 cttcttatgc acggaaagga agtaggaagc atcattggga agaaagggga gtcggttaag 1200 aggatccgcg aggagagtgg cgcgcggatc aacatctcgg aggggaattg tccggagaga 1260 atcatcactc tgaccggccc caccaatgcc atctttaagg ctttcgctat gatcatcgac 1320 aagctggagg aagatatcaa cagctccatg accaacagta ccgcggccag caggcccccg 1380 gtcaccctga ggctggtggt gccggccacc cagtgcggct ccctgattgg gaaaggcggg 1440 tgtaagatca aagagatccg cgagagtacg ggggcgcagg tccaggtggc gggggatatg 1500 ctgcccaact ccaccgagcg ggccatcacc atcgctggcg tgccgcagtc tgtcaccgag 1560 tgtgtcaagc agatttgcct ggtcatgctg gagacgctct cccagtctcc gcaagggaga 1620 gtcatgacca ttccgtacca gcccatgccg gccagctccc cagtcatctg cgcgggcggc 1680 caagatcggt gcagcgacgc tgcgggctac ccccatgcca cccatgacct ggagggacca 1740 cctctagatg cctactcgat tcaaggacaa cacaccattt ctccgctcga tctggccaag 1800 ctgaaccagg tggcaagaca acagtctcac tttgccatga tgcacggcgg gaccggattc 1860 gccggaattg actccagctc tccagaggtg aaaggctatt gggcaagttt ggatgcatct 1920 actcaaacca cccatgaact caccattcca aataacttaa ttggctgcat aatcgggcgc 1980 caaggcgcca acattaatga gatccgccag atgtccgggg cccagatcaa aattgccaac 2040 ccagtggaag gctcctctgg taggcaggtt actatcactg gctctgctgc cagtattagt 2100 ctggcccagt atctaatcaa tgccaggctt tcctctgaga agggcatggg gtgcagctag 2160 ggaagacgga gttgtcattg gaattcgaag cttgggcccg aacaaaaact catctcagaa 2220 gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attgagttta aacggtctcc 2280 agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac 2340 gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg 2400 accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc 2460 atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg 2520 gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg 2580 ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca 2640 taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt 2700 ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 2760 aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 2820 tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 2880 aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 2940 aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 3000 tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc 3060 aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 3120 tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 3180 ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 3240 taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 3300 agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 3360 caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 3420 tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 3480 gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 3540 cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 3600 caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 3660 ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 3720 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 3780 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 3840 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 3900 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 3960 gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 4020 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 4080 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 4140 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 4200 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 4260 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 4320 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 4380 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 4440 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 4500 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 4560 gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt 4620 attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa 4680 tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt 4740 catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 4800 cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 4860 ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca gcagatcaat tcgcgcgcga aggcgaagcg 4920 gcatgcataa tgtgcctgtc aaatggacga agcagggatt ctgcaaaccc tatgctactc 4980 cgtcaagccg tcaattgtct gattcgttac caattatgac aacttgacgg ctacatcatt 5040 cactttttct tcacaaccgg cacggaactc gctcgggctg gccccggtgc attttttaaa 5100 tacccgcgag aaatagagtt gatcgtcaaa accaacattg cgaccgacgg tggcgatagg 5160 catccgggtg gtgctcaaaa gcagcttcgc ctggctgata cgttggtcct cgcgccagct 5220 taagacgcta atccctaact gctggcggaa aagatgtgac agacgcgacg gcgacaagca 5280 aacatgctgt gcgacgctgg cgatatcaaa attgctgtct gccaggtgat cgctgatgta 5340 ctgacaagcc tcgcgtaccc gattatccat cggtggatgg agcgactcgt taatcgcttc 5400 catgcgccgc agtaacaatt gctcaagcag atttatcgcc agcagctccg aatagcgccc 5460 ttccccttgc ccggcgttaa tgatttgccc aaacaggtcg ctgaaatgcg gctggtgcgc 5520 ttcatccggg cgaaagaacc ccgtattggc aaatattgac ggccagttaa gccattcatg 5580 ccagtaggcg cgcggacgaa agtaaaccca ctggtgatac cattcgcgag cctccggatg 5640 acgaccgtag tgatgaatct ctcctggcgg gaacagcaaa atatcacccg gtcggcaaac 5700 aaattctcgt ccctgatttt tcaccacccc ctgaccgcga atggtgagat tgagaatata 5760 acctttcatt cccagcggtc ggtcgataaa aaaatcgaga taaccgttgg cctcaatcgg 5820 cgttaaaccc gccaccagat gggcattaaa cgagtatccc ggcagcaggg gatcattttg 5880 cgcttcagcc atacttttca tactcccgcc attcagag 5918

<210> 19

<211> 5460

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence

<220>

<223> Secuencia del plásmido pTOP-Tfam

<400> 19 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tgggccacca ccatcaccac caccatcatc atcatggcgg 360 cagatcttcc cctatactag gttattggaa aattaagggc cttgtgcaac ccactcgact 420 tcttttggaa tatcttgaag aaaaatatga agagcatttg tatgagcgcg atgaaggtga 480 taaatggcga aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat 540 tgatggtgat gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca 600 caacatgttg ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt 660 tttggatatt agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa 720 agttgatttt cttagcaagc tacctgaaat gctgaaaatg ttcgaagatc gtttatgtca 780 taaaacatat ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct 840 tgatgttgtt ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt 900 taaaaaacgt attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat 960 agcatggcct ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaatc 1020 ggatctggaa gttctgttcc aggggcccca tcaccatcac catcaccatc accatcacga 1080 tgacgatgac aagttttcca gcatgggtag ctatccaaag aaacctatga gttcatacct 1140 tcgattttcc acagaacagc tacccaaatt taaagctaaa cacccagatg caaaactttc 1200 agaattggtt aggaaaattg cagccctgtg gagggagcta ccagaagcag aaaaaaaggt 1260 ttatgaagct gattttaaag ctgagtggaa agcatacaaa gaagctgtga gcaagtataa 1320 agagcagcta actccaagtc agctgatggg tatggagaag gaggcccggc agagacggtt 1380 aaaaaagaaa gcactggtaa agagaagaga attaattttg cttggaaaac caaaaagacc 1440 tcgttcagca tataacattt atgtatctga aagcttccag gaggcaaagg atgattcggc 1500 tcagggaaaa ttgaagcttg taaatgaggc ttggaaaaat ctgtctcctg aggaaaagca 1560 ggcatatatt cagcttgcta aagatgatag gattcgttac gacaatgaaa tgaagtcttg 1620 ggaagagcag atggctgaag ttggacgaag tgatctcatc cgtcgaagtg tgaaacgatc 1680 cggagacatc tctgagcatt aaggaagacg gagttgtcat tggaattcga agcttgggcc 1740 cgaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatagcgcc gtcgaccatc atcatcatca 1800 tcattgagtt taaacggtct ccagcttggc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 1860 ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 1920 agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 1980 gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 2040 aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 2100 cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 2160 gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 2220 gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tctttttgtt tatttttcta aatacattca 2280 aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 2340 aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 2400 cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 2460 ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 2520 cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 2580 ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 2640 gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 2700 gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 2760 acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 2820 cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 2880 acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 2940 ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 3000 ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 3060 gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 3120 atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 3180 ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 3240 attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 3300 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 3360 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 3420 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 3480 ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 3540 tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 3600 ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 3660 cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 3720 agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 3780 gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 3840 ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 3900 tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 3960 tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 4020 cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 4080 tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 4140 gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 4200 atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc 4260 cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 4320 cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 4380 ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagcagatca 4440 attcgcgcgc gaaggcgaag cggcatgcat aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga 4500 ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg 4560 acaacttgac ggctacatca ttcacttttt cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc 4620 tggccccggt gcatttttta aatacccgcg agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat 4680 tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga 4740 tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg 4800 acagacgcga cggcgacaag caaacatgct gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt 4860 ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat 4920 ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg 4980 ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt 5040 cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg 5100 acggccagtt aagccattca tgccagtagg cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat 5160 accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca 5220 aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc 5280 gaatggtgag attgagaata taacctttca ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga 5340

gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc 5400

ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag ccatactttt catactcccg ccattcagag 5460

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador directo de reamplificación del inserto a clonar en pTOP por CipCR

<400> 20 tcaccatcac catcaccatc acgatgacga tgacaag 37

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cebador reverso de reamplificación del inserto a clonar en pTOP

por CipCR

<400> 21 gcccaagctt cgaattccaa tgacaactcc gtcttcctta 40

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Parte 5-del cebador directo para la clonación del inseto por

CipCR

<400> 22 cacgatgacg atgacaag 18

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Parte 5-del cebador reverso de clonación del inserto por CipCR

<400> 23 atgacaactc cgtcttcctt a 21