Proteínas de unión a antígenos, tetravalentes y biespecíficas.

Una proteína de unión a antígenos tetravalente y biespecífica,

que incluye:

a) una cadena pesada modificada de un primer anticuerpo,

que se une de manera específica a un primer antígeno,

y sobre cuyo extremo C-terminal de dicha cadena pesada se fusionan de manera adicional los dominios VH-CH1 de dicho primer anticuerpo mediante sus extremos N-terminal;

b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo de a);

c) una cadena pesada modificada de un segundo anticuerpo,

que se une de manera específica a un segundo antígeno,

en el que el dominio CH1 se remplaza por el dominio CL de dicho segundo anticuerpo y sobre cuyo extremo C-terminal de dicha cadena pesada se fusionan de manera adicional los dominios VH-CL de dicho segundo anticuerpo mediante sus extremos N-terminal; y

d) dos cadenas ligeras modificadas de dicho segundo anticuerpo de c), en las que el dominio CL se remplaza por el dominio CH1 de dicho segundo anticuerpo.

Proteínas de unión a antígenos, tetravalentes y biespecíficas La presente invención hace referencia a proteínas de unión a antígenos, tetravalentes y biespecíficas, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que incluyen dichos anticuerpos, y a las utilizaciones de los mismos.

Antecedentes de la invención Las proteínas diseñadas, tales como los anticuerpos bi- o multiespecíficos capaces de unir dos o más antígenos son conocidas en la materia. Tales proteínas de unión multiespecífica pueden generarse mediante la utilización de la fusión celular, la conjugación química o las técnicas de DNA recombinante.

En los últimos años se ha desarrollado una gran variedad de formatos de anticuerpos multiespecíficos recombinantes, como por ejemplo los anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante la fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena simple (véase, por ejemplo, Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; la patente WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234) .

También se han desarrollado varios formatos diferentes en los que no se mantiene la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , tales como dia-, tria- o tetracuerpos, minicuerpos y varios formatos de cadena simple (scFv, bis-scFv) capaces de unir dos o más antígenos (Holliger, P., et. al, Nature Biotech 23 (2005) 11261136; Fischer, N., y Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297) .

Todos estos formatos utilizan enlazantes para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína de unión adicional (por ejemplo, scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer, N., y Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14) . Aunque sea obvio que los enlazantes son ventajosos en el diseño de anticuerpos biespecíficos, también pueden ocasionar problemas en los ajustes terapéuticos. Además, estos péptidos extraños pueden provocar una respuesta inmunológica frente al mismo enlazante o frente al enlace entre la proteína y el enlazante. Adicionalmente, la naturaleza flexible de estos péptidos los hace más propensos a la escisión proteolítica, conduciendo potencialmente a una pobre estabilidad del anticuerpo, a la agregación y a una inmunogenicidad incrementada. Además, puede ser deseable mantener las funciones efectoras, tales como por ejemplo la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , que se median a través de la porción Fc, mediante el mantenimiento de un alto grado de similitud con los anticuerpos naturales.

Por consiguiente, y de forma ideal, cuando se desarrollan anticuerpos biespecíficos se debe intentar que estos sean muy similares a los anticuerpos naturales (como IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) en cuanto a su estructura general, con una mínima desviación de las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespecíficos muy similares a los anticuerpos naturales mediante la utilización de la tecnología de cuadromas (véase Milstein, C., y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540) basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresa anticuerpos murinos monoclonales con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. A causa del emparejamiento aleatorio de dos cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo en la línea celular del hibridohibridoma resultante (o cuadroma) , se generan hasta diez especies de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una es el anticuerpo biespecífico funcional deseado. Debido a la presencia de subproductos emparejados erróneamente y a unos rendimientos de producción significativamente reducidos se requieren procedimientos de purificación sofisticados (véase, por ejemplo Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234) . En general, si se utilizan técnicas de expresión recombinante se mantiene el mismo problema con los subproductos emparejados erróneamente.

Un enfoque para solventar el problema de los subproductos emparejados erróneamente, conocido como “botón en ojal”, tiene como objetivo forzar el emparejamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se remplazan los aminoácidos voluminosos por aminoácidos con cadenas laterales cortas para crear un “ojal”. Por contra, los aminoácidos con cadenas laterales grandes se introducen en el otro dominio CH3 para crear un “botón”. Mediante la coexpresión de estas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idénticas, que deben ser apropiadas para ambas cadenas pesadas) , se observó un mayor rendimiento en la formación de heterodímeros (“botón-ojal”) frente a la formación de homodímeros (“ojal-ojal” o “botón-botón”) (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; y la patente WO 96/027011) . El porcentaje de heterodímeros pudo aumentarse de forma adicional mediante el remodelado de las superficies de interacción de los dos dominios CH3, utilizando un enfoque de presentación de fagos y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterodímeros (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) . Se describen nuevos enfoques para la tecnología “botón en ojal”, por ejemplo en la patente PE 1 870 459 A1. Pese a que este formato parece muy atractivo, no se dispone de datos que describan una progresión hacia su utilización clínica. Una restricción importante de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parientes deben ser idénticas para prevenir el emparejamiento erróneo y la formación de moléculas inactivas. Por consiguiente, esta técnica no es apropiada para el desarrollo sencillo de anticuerpos biespecíficos recombinantes frente a dos antígenos a partir de dos anticuerpos frente al primer y al segundo antígeno, dado que se deben optimizar las cadenas pesadas de estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas. Este mismo problema de emparejamiento erróneo permanece cuando se expresan anticuerpos biespecíficos tetravalentes en vez de anticuerpos biespecíficos bivalentes mediante, por ejemplo, la fusión de fragmentos Fab adicionales (cada uno idéntico al fragmento Fab del anticuerpo respectivo que se une al primer o segundo antígeno) a cada extremo C-terminal de la cadena pesada del heterodímero (véase la figura 2) .

La patente WO 2006/093794 hace referencia a compuestos de unión a proteínas. La patente WO 99/37791 describe derivados de anticuerpos con múltiples propósitos. Morrison, S.L., et al en J. Inmunolog, 160 (1998) 2802-2808 hacen referencia a la influencia del intercambio del dominio de la región variable sobre las propiedades funciones de la IgG.

Resumen de la invención La invención incluye una proteína de unión a antígenos tetravalente y biespecífica, que incluye:

a) una cadena pesada modificada de un primer anticuerpo, que se une de manera específica a un primer antígeno, y sobre cuyo extremo C-terminal de dicha cadena pesada se fusionan de manera adicional los dominios VH- CH1 de dicho primer anticuerpo mediante sus extremos N-terminal;

b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo de a) ;

c) una cadena pesada modificada de un segundo anticuerpo, que se une de manera específica a un segundo antígeno, en el que el dominio CH1 se remplaza por el dominio CL de dicho segundo anticuerpo y sobre cuyo extremo C-terminal de dicha cadena pesada se fusionan de manera adicional los dominios VH-CL de dicho segundo anticuerpo mediante sus extremos N-terminal; y

d) dos cadenas ligeras modificadas de dicho segundo anticuerpo de c) ,

en las que el dominio CL se remplaza por el dominio CH1 de dicho segundo anticuerpo.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de una proteína de unión a antígenos de acuerdo con la invención que incluye los pasos de a) transformar una célula huésped con

- vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican por una proteína biespecífica de unión a antígenos de acuerdo con la invención

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo; y

c) recuperar dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped que incluye

- vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican por una proteína de unión a antígenos... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de unión a antígenos tetravalente y biespecífica, que incluye:

a) una cadena pesada modificada de un primer anticuerpo, que se une de manera específica a un primer antígeno, y sobre cuyo extremo C-terminal de dicha cadena pesada se fusionan de manera adicional los dominios VH- CH1 de dicho primer anticuerpo mediante sus extremos N-terminal;

b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo de a) ;

c) una cadena pesada modificada de un segundo anticuerpo, que se une de manera específica a un segundo antígeno, en el que el dominio CH1 se remplaza por el dominio CL de dicho segundo anticuerpo y sobre cuyo extremo C-terminal de dicha cadena pesada se fusionan de manera adicional los dominios VH-CL de dicho segundo anticuerpo mediante sus extremos N-terminal; y

d) dos cadenas ligeras modificadas de dicho segundo anticuerpo de c) , en las que el dominio CL se remplaza por el dominio CH1 de dicho segundo anticuerpo.

2. La proteína de unión a antígenos de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que tanto el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de a) como el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de b) se encuentran en la interfaz, que incluye una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en el que dicha interfaz se altera para promover la formación de la proteína de unión a antígenos, tetravalente y biespecífica, en la que la alteración se caracteriza por que:

i) el dominio CH3 de una cadena pesada se altera, para que en la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada en la proteína de unión a antígenos tetravalente y biespecífica, se sustituya un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido con una cadena lateral de mayor volumen para generar así una protuberancia en la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, que se puede colocar en una cavidad de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada y

ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada se altera, para que en la interfaz original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfaz original del primer dominio CH3 de la proteína de unión a antígenos tetravalente y biespecífica, se sustituya un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido con una cadena lateral de menor volumen para generar así una cavidad en la interfaz del segundo dominio CH3, en la que se puede colocar una protuberancia de la interfaz del primer dominio CH3.

3. La proteína de unión a antígenos de acuerdo con la reivindicación 2, que se caracteriza por que tal residuo de aminoácido con un volumen mayor de cadena lateral se selecciona a partir del grupo que incluye arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptófano (W) , y tal residuo de aminoácido con un volumen menor de cadena lateral se selecciona a partir del grupo que incluye alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .

4. La proteína de unión a antígenos de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, que se caracteriza por que ambos dominios CH3 se alteran de forma adicional mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes a cada dominio CH3 para que se forme un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

5. Un método para la preparación de una proteína de unión a antígenos biespecífica y tetravalente de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que incluye los pasos de

a) transformar una célula huésped con vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican por una proteína biespecífica de unión a antígenos de acuerdo con las reivindicaciones 1 to 4

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de proteína de unión a antígenos; y

c) recuperar dicha molécula de proteína de unión a antígenos de dicho cultivo.

6. Una célula huésped que incluye los vectores de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un composición farmacéutica que incluye la proteína de unión a antígenos biespecífica y tetravalente de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 y, al menos, un excipiente farmacológicamente aceptable.

8. La proteína de unión a antígenos biespecífica y tetravalente de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 para el tratamiento del cáncer.

9. La utilización de la proteína de unión a antígenos biespecífica y tetravalente de acuerdo con las reivindicaciones 1

o 4 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.