Proteínas quiméricas hipoalergénicas pertenecientes a la familia de transferencia de lípidos de Parietaria judaica para usar en el tratamiento de alergias.

Una proteína quimérica que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias que corresponden a los principales alergenos del polen de Parietaria judaica conocidos como Par j 1 y Par j 2,

la secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica carece de uno o más epítopos para la unión a anticuerpos IgE correspondientes a las secuencias de la cual se deriva, y en donde la proteína no tiene una reducción en la inmunogenicidad, caracterizada porque la proteína comprende la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 4.

Proteínas quiméricas hipoalergénicas pertenecientes a la familia de transferencia de lípidos de Parietaria judaica para usar en el tratamiento de alergias.

La presente Invención se relaciona con el campo de la producción de proteínas quiméricas para la prevención y tratamiento de alergias, particularmente las alergias al polen y las más particularmente alergias causadas por los alérgenos de la familia de proteínas de transferencia de lípidos y más específicamente los que se encuentran en el polen de las especies de Parietaria.

Antecedentes de la invención

Las alergias tipo I son un problema de salud importante en los países industrializados. Este tipo de alergia es causada por la formación de anticuerpos IgE contra antígenos transportados por el aire. Estos anticuerpos IgE interactúan con las mastocitos y basófilos, liberando mediadores biológicos tales como histamina, y causando la rinitis alérgica, conjuntivitis y asma bronquial en aproximadamente 20 % de la población [(1)Miyamoto, T. (1992). Increased prevalence of pollen allergy in Japan. In Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, y F.B. Michel, eds. (Cornforth, UK: The Parthenon Publishing Group), pp. 343-37],

La inmunoterapia específica (SIT) es un tratamiento eficaz para las reacciones alérgicas provocadas por alérgenos específicos y, básicamente, consiste en la modulación de la respuesta inmune en el paciente por la administración regular, aumentando la concentración, de las proteínas que producen la alergia (extractos alergénicos). Las altas dosis de los alérgenos inyectados inducen la alta síntesis de IL-12 por las células presentadoras de antígeno, por ejemplo las células dendríticas, que promueven preferentemente el desarrollo de las células T que son células vírgenes cooperativas (nTH) hacia Th1 o ThO. Esto permite una desviación de la respuesta inmune del tipo de respuesta alérgica relacionada con las células TH2 hacia una respuesta tipo Th1/Th0 que conduce a la producción de altos niveles de IFN- y [(2) Akdis., C.A. y Blaser, K. (2000). Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 55, 522-530], La desviación inmune se refuerza por la inducción de la tolerancia (anergia para la supresión clonal) de céluas Th2 de memoria bajo la influencia de la de las células T reguladoras (Tr1) que producen las citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-beta [(3) Akdis, C.A., Joss, A., Akdis, M., y Blaser, K. (2001). Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens. Int. Arch Allergy Immunol. 124; 180-182], La reducción en la activación y proliferación de las células TH2 se acompaña por producción reducida de IL-4, y de IgEs por las células B. La reducción en la actividad y la infiltración de las células Th2 en el moco nasal y bronquial resulta en la síntesis de IL-5 reducida, permitiendo una reducción en la infiltración de eosinófilos que conduce a una gran reducción en la liberación de mediadores inflamatorios, tales como las proteínas MBP y ECP. Los nuevos clones específicos de células T del alérgeno fenotipo predominante Th>0 producen una mezcla de citoquinas de los tipos Th1 y Th2 que promueven la producción de una gran cantidad de anticuerpos IgG específicos a alérgenos por las células B. Por otra parte, los altos niveles de IL-10 inducen la alta síntesis de anticuerpos lgG4 específicos a alérgenos. Estos dos tipos de anticuerpos específicos pueden actuar como anticuerpos bloqueadores que proporcionan la intersección de los anticuerpos IgE combinados con sus receptores en los mastocitos y por lo tanto Inhiben la desgranulación y liberación de histamina [(4) Moverate, R. (2003). Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: impllcatlons for diagnostics and the development of improved vacclnatlon strategles. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97; (5) Wachholz, P.A., Soni, N.K., Till, S., y Durham, S.R., (2003). Inhibitlon of allergen-lgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 112; 915-922], Además bloquean la recolección de antígeno mediado por IgE por las células que contienen antígeno, y esto suprime la reacción inmune a los alérgenos.

Los extractos de alérgenos, aislados de fuentes naturales son mezclas complejas de proteínas y otras moléculas. Su composición, y por lo tanto la alergenicidad, depende del material usado, que varía de acuerdo con las condiciones ambientales, el estado de maduración en el caso de polen y las condiciones de crecimiento de los ácaros, etc., en el caso de los hongos, etc. Algunos extractos pueden contener Incluso una concentración inadecuada de los principales alérgenos y pueden contaminarse con componentes indeseables a los que el paciente no es alérgico, o ambos. La inmunoterapia actual usa extractos de alérgeno completo exclusivamente, y esto conduce a una serie de problemas tales como:

- reacciones adversas graves debido a la reactividad de la vacuna con IgE de las células efectoras.

- aparición de nueva sensibilización a otros alérgenos presentes en la vacuna después de la inmunoterapia.

- dificultades en la estandarización de los extractos de alérgenos.

Todo esto significa que la Inmunoterapia no es un tratamiento que es tan seguro y eficaz como se desea. Un mejor conocimiento de la patogénesis de la alergia y de los mecanismos de la inmunoterapia específica ha permitido estar más cerca de la solución a los problemas antes mencionados. El conocimiento de la influencia del antígeno mediado por IgE en la respuesta de TH2 específica a alérgeno ha aumentado los esfuerzos para crear alérgenos que no se unen a IgE. El objeto principal de la inmunoterapia específica actual consiste en modificar el alérgeno con el fin de inactivar los epítopos de IgE, reduciendo así e incluso eliminando la unión a la IgE y en consecuencia las reacciones adversas [(6) Valenta, R. y Linhart, B. (2005). Molecular design of allergy vaccines. Curr. Opin. Immunol. 17, 1-10]. De esta manera, el alérgeno modificado se dirigirá hacia las células T por un mecanismo de recolección de antígeno mediada por

pinocitosis/ fagocitosis, previniendo la intersección IgE y la presentación del antígeno dependiente de IgE. Esto induce un equilibrio en la producción de citoquinas ThO o Th1 por las células T, menos producción de IgE y más producción de IgG por las células B; todo esto conducirá a la inducción de la tolerancia de la célula de tipo TH2 sin riesgo de anafilaxis. Los avances en los métodos recombinantes para obtener los alérgenos y derivados de alérgenos ha permitido un gran aumento de la capacidad para desarrollar nuevas vacunas para el tratamiento de las alergias. Esto ha sido posible debido a la posibilidad de mutar o suprimir aminoácidos significativos de epítopos IgE, así como el fraccionamiento y oligomerización de estos para obtener vacunas hipoalergénicas. Estas moléculas que tienen una menor capacidad de unirse a IgE pero mantienen su reactividad hacia las células T se pueden administrar en dosis mayores, lo que permite lun inmunoterapia más rápida y más segura con un número más pequeño de inyecciones. Adicionalmente, los alérgenos recombinantes se pueden producir a gran escala en tanques de fermentación, usando sistemas de expresión microbianos, y la purificación de estos es más eficiente y barata que la de sus equivalentes naturales. El uso de derivados hipoalérgicos en inmunoterapia se ha descrito previamente usando fragmentos de trímeros de Bet v 1 [(7) Niederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, P., Reisinger, J., Pelzmann, M., Hayek, B., Kronqvist, M., Gafvelin, G., Grónlund, H., Purohit, A., Suck, R., Fiebig, H., Cromwell, 0., Pauli, G., van Flage-Flamsten, M., y Valenta, R. (2004). Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A A. 101, 14677-14682], multi-allergenic hybrids of bee venon proteins (Api m 1, 2, 3) [(8) Schmid-Grendelmeier, P., Karamloo, F., Müller, U., Flousley-Marcovic, Z., Soldatova, L., Zumkehr, J., Kemeny, D.M., Kündig, T., Reimers, A, von Beust, B.R., Salagianni, M., Akdis, M., Kussebi, F., Spangfort, M.D., Blaser, K., y Akdis, C.A. (2005). Prevention of allergy by a recombinant multi-allergen vaccine with reduced IgE binding and preserved T cell epitopes. Eur. J. Immunol. 35, 3268-3276] y fusiones mutadas de Par j 2 y Par j 1 para eliminar su estructura terciaria.

Algunos autores mencionan que las vacunas alergénicas no deben prepararse con hipoalergenos ya que la unión a IgE podría facilitar la captura y presentación del alérgeno por las células presentadoras de antígeno profesionales, como las células... [Seguir leyendo]

1. Una proteína quimérica que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias que corresponden a los principales alérgenos del polen de Parietaria judaica conocidos como Par j 1 y Par j 2, la secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica carece de uno o más epítopos para la unión a anticuerpos IgE correspondientes a las secuencias de la cual se deriva, y en donde la proteína no tiene una reducción en la inmunogenicidad, caracterizada porque la proteína comprende la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 4.

2. Una proteína quimérica que consiste en la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 4.

3. Una proteína quimérica como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para usar como un medicamento.

4. La proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 3 para usar en el tratamiento de un trastorno inmunológico.

5. La proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 4 para usar en el tratamiento de la alergia.

6. La proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la alergia es una alergia al polen de

Parietaria judaica.

7. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

8. Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 3.

9. Un vehículo de expresión microbiano en un organismo huésped transformado, que se auto-replica y se usa para expresar el polinucleótido de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Un organismo huésped, distinto de un ser humano, que se transforma con un vehículo de expresión microbiana

de acuerdo con la reivindicación 9.

11. El organismo de acuerdo con la reivindicación 10, donde el organismo es procariota.

12. El organismo de acuerdo con la reivindicación 11, el organismo procariota pertenece al género E. coli.

13. El organismo de acuerdo con la reivindicación 10, donde el organismo es eucariota.

14. Un método para producir un polipéptido que contiene una proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 1

o la reivindicación 2 caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo huésped que contiene un vehículo de expresión microbiana que se auto-replica en el organismo antes mencionado y se usa para expresar la proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

15. Un método para purificar la proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende el aislamiento de este del cultivo, las células o ambos.

16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la composición es una composición de vacuna.