Proteínas de fusión que comprenden una proteasa no citotóxica, un resto director, un sitio de escisión de proteasa y un dominio de traslocación.

Una proteína de fusión polipeptídica de una cadena, que comprende:

(a) una proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, cuya proteasa o fragmento de proteasa es capaz deescindir específicamente una proteína SNARE del aparato de fusión exocítico de una célula diana;

(b) un resto director que es capaz de unirse a un sitio de unión en la célula diana, cuyo sitio de unión es capaz deexperimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro de la célula diana;

(c) un sitio de escisión de proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión es escindida por una proteasa, en el que elsitio de escisión de proteasa está situado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto director,de modo que cuando el sitio de escisión de proteasa se escinde, la región N-terminal del resto director quedaexpuesta; y

(d) un domino de traslocación que es capaz de traslocar la proteasa o fragmento de proteasa desde dentro de unendosoma, a través de la membrana del endosoma y al citosol de la célula diana;

en el que el resto director está situado entre el sitio de escisión de proteasa y el dominio de traslocación; y en el queel resto director tiene un dominio N-terminal que es capaz de unirse al sitio de unión en la célula diana.

Proteínas de fusión que comprenden una proteasa no citotóxica, un resto director, un sitio de escisión de proteasa y un dominio de traslocación.

Esta invención se refiere a proteínas de fusión no citotóxicas y a la aplicación terapéutica de las mismas.

Las toxinas se pueden dividir en general en dos grupos de acuerdo con el tipo de efecto que tienen en una célula diana. Con más detalle, el primer grupo de toxinas mata a sus células diana naturales, y por lo tanto se conocen como moléculas de toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas se ilustra, entre otros, por las toxinas vegetales tales como ricina y abrina, y por toxinas bacterianas tales como la toxina diftérica y exotoxina A de Pseudomonas. Las toxinas citotóxicas han atraído mucho interés en el diseño de "balas mágicas" (p. ej., inmunoconjugados que comprenden un componente de toxina citotóxica y un anticuerpo que se une a un marcador

específico en una célula diana) para el tratamiento de trastornos y afecciones celulares tales como el cáncer. Las toxinas citotóxicas típicamente matan sus células diana inhibiendo el proceso celular de síntesis de proteínas.

El segundo grupo de toxinas, conocidas como toxinas no citotóxicas, no matan (como confirma su nombre) a sus células diana. Las toxinas no citotóxicas han atraído mucho menos interés comercial que sus homólogas citotóxicas, y ejercen sus efectos en una célula diana inhibiendo procesos celulares distintos de la síntesis de proteínas. Las toxinas no citotóxicas son producidas por una variedad de plantas, y por una variedad de microorganismos tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.

Las neurotoxinas clostridiales son proteínas que típicamente tienen una masa molecular del orden de 150 kDa. Son producidas por diferentes especies de bacterias, en especial del género Clostridium, las más importantes C. tetani y varias cepas de C. botulinum, C. butyricum y C. argentinense. Hay presentes 8 clases diferentes de neurotoxinas clotridiales, en concreto: toxina tetánica y neurotoxina botulímica en los serotipos A, B, C1, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modos de acción similares.

Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo principal de moléculas de toxinas no citotóxicas, y son sintetizadas por la bacteria hospedante como polipéptidos sencillos que son modificados de forma postraduccional por un suceso de escisión proteolítico para formar dos cadenas de polipéptido unidas entre sí por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se denominan la cadena pesada (cadena H) , que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L) , que tiene una masa molecular de aproximadamente 50

kDa.

Las cadenas L tienen una función de proteasa (actividad de endopeptidasa dependiente de cinc) y presentan una alta especificidad de sustrato para proteínas asociadas a vesícula y/o membrana plasmática implicadas en el proceso exocítico. Las cadenas L de diferentes especies clostridiales o serotipos pueden hidrolizar

enlaces peptídicos diferentes pero específicos en una de las tres proteínas sustrato, en concreto sinaptobrevina, sintaxina o SNAP- 25. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.

Neisseria sp., la más importante de la especie N. gonorrhoeae, produce proteasas no citotóxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de dicha proteasa es la proteasa IgA (véase el documento WO99/58571) .

Se ha documentado bien en la materia que las moléculas de toxinas se pueden redirigir a una célula que no es la célula diana natural de la toxina. Cuando es redirigida de esta forma, la toxina modificada es capaz de unirse a una célula diana deseada y, después de la posterior traslocación al citosol, es capaz de ejercer su efecto en la célula diana. Esta redirección se logra sustituyendo el resto director (TM, por sus siglas en inglés Targeting

Moiety) natural de la toxina por un TM distinto. En relación con esto, el TM se selecciona de modo que se unirá a una célula diana deseada, y permitirá el posterior paso de la toxina modificada a un endosoma dentro de la célula diana. La toxina modificada también comprende un dominio de traslocación para permitir la entrada de la proteasa no citotóxica en el citosol de la célula. El dominio de traslocación puede ser el dominio de traslocación natural de la toxina o puede ser un dominio de traslocación diferente obtenido de una proteína microbiana con actividad de 55 traslocación.

Por ejemplo, el documento WO94/21300 describe moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que son capaces de regular la densidad de proteínas integrales de membrana (PIM) presente en la superficie celular de la célula diana. Las moléculas de neurotoxinas modificadas son así capaces de controlar la actividad celular (p.

ej., captación de glucosa) de la célula diana. Los documentos WO96/33273 y WO99/17806 describen moléculas de neurotoxinas clostridiales modificada que se dirigen a aferentes sensitivos periféricos. Por lo tanto las moléculas de neurotoxina modificadas son capaces de demostrar un efecto analgésico. El documento WO00/10598 describe la preparación de moléculas de neurotoxinas clostridiales que se dirigen a células hipersecretoras de moco (o células 5 neuronales que controlan dichas células hipersecretoras de moco) , cuyas neurotoxinas modificadas con capaces de inhibir la hipersecreción de dichas células. El documento WO01/21213 describe moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que se dirigen a una amplia variedad de diferentes tipos de células diana no neuronales. Por lo tanto, las moléculas modificadas son capaces de prevenir la secreción de las células diana. Las publicaciones adicionales en el campo técnico de moléculas de toxinas redirigidas incluyen: documentos WO00/62814;

WO00/04926; US5.773.586; WO93/15766; WO00/61192; WO99/58571; y WO04/024909.

La sustitución del TM mencionado antes se puede realizar por técnicas de conjugación química convencionales, que son bien conocidas para un experto en la materia. En relación con esto, se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996) , Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991) , Chemistr y of protein conjugation and cross-linking, CRC Press.

Sin embargo, la conjugación química a menudo es imprecisa. Por ejemplo, después de conjugación, un TM puede quedar unido al resto del conjugado en más de un sitio de unión.

La conjugación química también es difícil de controlar. Por ejemplo, un TM puede quedar unido al resto de la toxina modificada en un sitio de unión en el componente de proteasa y/o en el componente de traslocación. Esto es problemático cuando se desea la unión a solo uno de dichos componentes (preferiblemente en un solo sitio) para la eficacia terapéutica.

Por lo tanto, la conjugación química produce una población mixta de moléculas de toxina modificadas, que no es deseable.

Como alternativa a la conjugación química, la sustitución del TM se puede realizar mediante preparación recombinante de una sola proteína de fusión polipeptídica (véase el documento WO98/07864) . Esta técnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo por el cual se prepara la neurotoxina clostridial natural (es decir, holotoxina) , y produce una proteína de fusión que tiene la siguiente disposición estructural:

NH2 - [componente de proteasa] - [componente de traslocación] - [TM] - COOH

De acuerdo con el documento WO98/07864, el TM está situado hacia el extremo C-terminal de la proteína de fusión. La proteína de fusión después se activa por tratamiento con una proteasa, que escinde en un sitio entre el componente de proteasa y el componente de traslocación. Así se produce una proteína de dos cadenas, que comprende el componente de proteasa como una sola cadena de polipéptido unida covalentemente (por un enlace disulfuro) a otra cadena individual de polipéptido que contiene el componente de traslocación más el TM. Mientras que la metodología del documento WO98/07864 sigue (en términos de disposición estructural de la proteína de fusión) el sistema de expresión natural de la holotoxina clostridial, los autores de la presente invención han encontrado que este sistema puede dar como resultado la producción de determinadas proteínas de fusión que tienen una capacidad de unión sustancialmente reducida para la célula diana prevista.

Por lo tanto, es necesario un sistema alternativo o mejorado para construir una proteína de fusión no citotóxica.

La presente invención aborda uno o más de los problemas mencionados antes proporcionando una proteína de fusión polipeptídica de una cadena como... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión polipeptídica de una cadena, que comprende:

(a) una proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, cuya proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir específicamente una proteína SNARE del aparato de fusión exocítico de una célula diana;

(b) un resto director que es capaz de unirse a un sitio de unión en la célula diana, cuyo sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro de la célula diana;

(c) un sitio de escisión de proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión es escindida por una proteasa, en el que el sitio de escisión de proteasa está situado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto director, de modo que cuando el sitio de escisión de proteasa se escinde, la región N-terminal del resto director queda expuesta; y

(d) un domino de traslocación que es capaz de traslocar la proteasa o fragmento de proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana del endosoma y al citosol de la célula diana;

en el que el resto director está situado entre el sitio de escisión de proteasa y el dominio de traslocación; y en el que el resto director tiene un dominio N-terminal que es capaz de unirse al sitio de unión en la célula diana.

2. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el resto director y el sitio de escisión de la proteasa están separados como máximo por 10 restos de aminoácidos, preferiblemente como máximo por 5 restos de aminoácidos, y más preferiblemente como máximo por cero restos de aminoácidos.

3. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la proteasa no citotóxica es una cadena L de neurotoxina clostridial.

4. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el dominio de traslocación es el dominio HN de una neurotoxina clostridial.

5. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el resto director comprende como máximo 50 restos de aminoácidos, preferiblemente como máximo 40 restos de aminoácidos, más preferiblemente como máximo 30 restos de aminoácidos y lo más preferiblemente como máximo 20 restos de aminoácidos.

6. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el resto director comprende un ligando PAR, preferiblemente el ligando PAR1.

7. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el resto director es un ligando que se une a PTH-1, preferiblemente el ligando comprende un péptido PTH; o en la que el resto director comprende una secuencia de unión a integrina lineal o cíclica, preferiblemente una secuencia de unión triple Arg-Gly-Asp (RGD) .

8. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el resto director se une a una célula seleccionada del grupo que consiste en: una célula secretora de moco o una célula neuronal que controla o dirige la secreción de moco; una célula endocrina; una célula inflamatoria; una célula exocrina; una célula inmunológica; una célula cardiovascular; o una célula ósea.

9. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el resto director es un ligando seleccionado del grupo que consiste en: TFLLR; PAR-1; PTH; VIP o un análogo de VIP seleccionado del grupo que consiste en [R15, 20, 21, L17]-VIP, [R15, 20, 21, L17]-VIP-GRR, [A2, 8, 9, 16, 19.

24. VIP o [A2, 8, 9, 16, 19, 24.

25. VIP; agonistas de receptor adrenérgico beta2; péptido liberador de gastrina (GRP) ; péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) ; hormona estimulante de tiroides (TSH) ; insulina; factor de crecimiento similar a insulina; hormona liberadora de TSH (protirelina) ; hormona liberadora de FSH/LH (gonadorelina) ; hormona liberadora de corticotrofina (CRH) ; hormona adenocorticotrófica (ACTH) ; péptido activante de la adenilciclasa hipofisaria; un ligando para el dominio C4 de Fc de IgE; un ligando para el receptor de complemento C3a/C4a-R; un antígeno reactivo hacia el receptor de complemento CR4; factor estimulador de macrófagos; un antígeno asociado con el receptor de complemento iC3b; IL8; fragmento/elemento de superficie del virus de Epstein Barr; trombina; péptido

agonista del receptor de trombina (TRAP) ; anticuerpos de reconocimiento del antígeno de superficie GP1 b; calcitonina; el factor de diferenciación de osteoclastos TRANCE, RANKL, o OPGL; un péptido lineal o cíclico seleccionado del grupo que consiste en: THALWHT, LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC) , LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) , LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) , CDSAFVTVDWGRSMSLC, SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP, FSLSKPP, HSMQLST, STQAMFQ; y ANP.

10. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína de fusión comprende un marcador de purificación.

11. La fusión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la proteína de fusión comprende un marcador de purificación, que está presente en el extremo N y/o el extremo C de la proteína de fusión.

12. La proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en la que el marcador de purificación está unido a la proteína de fusión por una molécula espaciadora peptídica.

13. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el dominio de traslocación está separado del resto director por una molécula espaciadora peptídica.

14. Una proteína de fusión polipeptídica que comprende cualquiera de las SEQ ID nº: 10, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 y 33.

15. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión polipeptídica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

16. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la molécula de ácido nucleico comprende una cualquiera de las SEQ ID nº: 1-9, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29 y 32.

17. Un vector de ADN, que comprende un promotor, una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16, en el que dicha secuencia de ADN está situada en la dirección 3' del promotor, y un terminador está situado en la dirección 3' de la construcción de ADN.

18. La cadena de ADN complementaria de la secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16.

19. Un procedimiento para preparar una proteína de fusión polipeptídica de una cadena de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende expresar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16, o un vector de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, en una célula hospedante.

20. Un procedimiento para preparar un agente no citotóxico, que comprende:

(a) poner en contacto una proteína de fusión polipeptídica de una cadena de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, con una proteasa capaz de escindir el sitio de escisión de proteasa;

(b) escindir el sitio de escisión de proteasa;

formando así una proteína de fusión de doble cadena.

21. Un polipéptido no citotóxico, que se puede obtener por el procedimiento de la reivindicación 20, en el que el polipéptido es un polipéptido de doble cadena, y en el que:

(a) la primera cadena comprende la proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, cuya proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítico de una célula diana;

(b) la segunda cadena comprende el TM y el dominio de traslocación que es capaz de traslocar la proteasa o fragmento de proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana del endosoma y al citosol de la célula diana; y

la primera y segunda cadena están unidas entre sí por disulfuro.

22. Uso de una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 21, para la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar una afección médica o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en hipersecreción mucosa, asma, y/o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neoplasia endocrina incluyendo MEN, tirotoxicosis y otras enfermedades dependientes de hipersecreciones del tiroides; acromegalia, hiperprolactinemia, enfermedad de Cushing y otras enfermedades dependientes de la hipersecreción de la hipófisis anterior; hiperandrogenismo, anovulación crónica y otras enfermedades asociadas con el síndrome del ovario poliquístico, alergias (rinitis alérgica estacional (fiebre del heno) , conjuntivitis alérgica, rinitis vasomotora y alergia alimentaria) , eosinofilia, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, hemorroides, prurito, glomerulonefritis, hepatitis, pancreatitis, gastritis, vasculitis, miocarditis, psoriasis, eczema, fibrosis inducida por radiación crónica, cicatrización pulmonar y otros trastornos fibróticos, hipersecreción mucosa de células secretoras de moco que se encuentran en el tracto alimentario, en particular que se encuentran en el colon, miastenia grave, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, trasplante de órganos, trasplante de tejidos, trasplante de fluido, enfermedad de Graves, tirotoxicosis, diabetes autoinmune, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatitis autoinmune crónica, gastritis autoinmune, anemia perniciosa, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, polimiositis, esclerodermia, esclerosis sistémica, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso, miocarditis, carditis reumática, glomerulonefritis (tipo Goodpasture) , uveítis, orquitis, colitis ulcerosa, vasculitis, gastritis atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus de tipo 1, afecciones cardiovasculares y/o hipertensión, y afecciones óseas tales como la osteopetrosis y osteoporosis.

23. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 21, para usar para tratar, prevenir o mejorar una afección médica o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en hipersecreción mucosa, asma, y/o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neoplasia endocrina incluyendo MEN, tirotoxicosis y otras enfermedades dependientes de hipersecreciones del tiroides; acromegalia, hiperprolactinemia, enfermedad de Cushing y otras enfermedades dependientes de la hipersecreción de la hipófisis anterior; hiperandrogenismo, anovulación crónica y otras enfermedades asociadas con el síndrome del ovario poliquístico, alergias (rinitis alérgica estacional (fiebre del heno) , conjuntivitis alérgica, rinitis vasomotora y alergia alimentaria) , eosinofilia, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, hemorroides, prurito, glomerulonefritis, hepatitis, pancreatitis, gastritis, vasculitis, miocarditis, psoriasis, eczema, fibrosis inducida por radiación crónica, cicatrización pulmonar y otros trastornos fibróticos, hipersecreción mucosa de células secretoras de moco que se encuentran en el tracto alimentario, en particular que se encuentran en el colon, miastenia grave, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, trasplante de órganos, trasplante de tejidos, trasplante de fluido, enfermedad de Graves, tirotoxicosis, diabetes autoinmune, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatitis autoinmune crónica, gastritis autoinmune, anemia perniciosa, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, polimiositis, esclerodermia, esclerosis sistémica, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso, miocarditis, carditis reumática, glomerulonefritis (tipo Goodpasture) , uveítis, orquitis, colitis ulcerosa, vasculitis, gastritis atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus de tipo 1, afecciones cardiovasculares y/o hipertensión, y afecciones óseas tales como la osteopetrosis y osteoporosis.