Proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de VPH y péptidos de inmunopotenciación de tratamiento y prevención del cáncer cervicouterino.

Una proteína de fusión, que comprende

- un polipéptido de fusión de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano,

en el que(1) la sección de la proteína E6 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 3, y(2) la sección de la proteína E7 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 5,

- un péptido señal para secretar el polipéptido hacia fuera de la célula, y

- un péptido inmunopotenciador elegido del grupo que consiste en un ligando de CD40 y un ligando de Flt3.

Proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de VPH y péptidos de inmunopotenciación de tratamiento y prevención del cáncer cervicouterino Campo de la técnica La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano (VPH) , un péptido señal para secretar el polipéptido de la célula y un péptido inmunopotenciador para un sujeto; un polinucleótido que codifica la proteína de fusión; un vector que contiene el polinucleótido; una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión o el vector; y la proteína de fusión para usar en un procedimiento para tratar una enfermedad causada por un virus del papiloma humano usando la composición farmacéutica.

Técnica anterior

El cáncer cervicouterino se ha convertido el la segunda causa principal de muerte por cáncer, responsable de 250.000 muertes anuales en todo el mundo. Se sabe que el cáncer cervicouterino se debe principalmente a la infección por el virus del papiloma humano (VPH) (zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78) . Entre los cientos de tipos de VPH, el VPH16 se conoce como la causa principal de cáncer cervicouterino (Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964) . Entre las proteínas del VOH, las proteínas E6 y E7 desempeñan papeles cruciales en la aparición de cáncer cervicouterino como oncogenes y se ha notificado que son las principales proteínas que se expresan en aproximadamente el 99% de los tumores causados por los VPH. Como resultado, las proteínas E6 y E7 se han convertido en un antígeno diana mayoritario en la preparación de una vacuna para tratar y prevenir el cáncer cervicouterino (von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834) . La E6 previene la apoptosis de las células induciendo la descomposición de una proteína inhibidora de tumores p53, y E7 se une a una proteína de retinoblastoma (Tb) que es un supresor tumoral celular, para inactivar la proteína y, después, para inducir las células a entrar en una fase S en el ciclo celular (Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5) .

Se realizó un ensayo clínico que usa una composición que expresa una secuencia de bases de ácido nucleico que expresa las proteínas E6 y E7 del VPH16 al mismo tiempo con el fin de tratar el cáncer cervicouterino, pero su efecto terapéutico no fue significativo (Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326) . Además, la publicación de patente internacional WO 2004/030636 divulga un polipéptido de fusión que comprende E6 y E7, en el que E6 está en un extremo amino o un extremo carboxilo, y un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión. No obstante, el polipéptido como se divulga en el presente documento todavía tiene la limitación en el tratamiento del cáncer cervicouterino causado por el VPH.

H. Hauser et al. describen una proteína del choque térmico secretora como molécula dirigida a las células dendríticas: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines (Gene Therapy 2004 (11) 924-932) . Una proteína de fusión que comprende un péptido señal, el antígeno E7 del VPH y HSP70 se usa in vivo.

T Daemen et al. describen una estrategia de inmunización contra el cáncer cervicouterino que implica un vector alfavirus que expresa niveles elevados de una proteína de fusión estable de E6 y E7 del virus del papiloma human 16 (Gene Therapy 2002 (9) 85-94) .

M.C. Cassetti et al. describen la eficacia antitumoral de las partículas de replicón del virus de la encefalitis equina venezolana que codifican genes mutados de E6 y E7 del VPH16 (Vaccine 22 (2004) 520-527) .

El documento WO 2004/037175 A2 divulga procedimientos de tratamiento de una enfermedad mediada por el VPH mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un epítopo de una proteína de VPH de origen natural.

Y-K Cheung et al. describen un tipo de ADN de 16 (VPH16) construido con optimización de codones mejoró la inmunogeneicidad contra la infección por VPH (Vaccine 23 (2004) 629-638) .

Seo Sang Hwan et al describen la inducción óptima de las respuestas de linfocitos T CD8+ inducidas por la vacuna del ADN del VPH y el efecto antitumoral terapéutico mediante ingeniería antigénica y electroporación (Vaccine 27 (2009) 5906-5912) .

Los presentes inventores han encontrado que una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un polipéptido de fusión de E6/E7 del VPH unido a un péptido secretor y el ligando de CD40 o el ligando Flt3 como péptido inmunopotenciador mejora las respuestas inmunitarias y es eficaz en el tratamiento y la prevención de los tumores causados por el VPH, de modo que se realiza la presente invención.

Divulgación Solución de la técnica Es un objeto de la presente invención proporcionar una proteína de fusión que es altamente eficaz en el tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VPH.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un polinucleótido que codifica la proteína de fusión.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un vector recombinante que comprende el polinucleótido.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende la proteína 5 de fusión y el vector recombinante.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar la composición farmacéutica para usar en un procedimiento para el tratamiento o prevención de enfermedades causadas por el VPH en un sujeto.

Descripción de las figuras La Fig. 1 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+

específicos de E7 producidas por la vacunación de ADN plasmídico que expresa Bock, E6Co, E7Co, E67 y E67Co, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6.

La Fig. 2 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de E6 producidas por la vacunación con simulado, E6Co, E7Co, E67 y E67Co, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6.

La Fig. 3 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de los efectos antitumorales profilácticas frente a la inyección subcutánea de células tumorales TC-1 indicada por el incremento del volumen de la masa tumoral en ratones C57BL/6 vacunados con simulado, E6Co, E7Co, E67 y E67Co, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo.

La Fig. 4 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de E7 producidas por el tratamiento con tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6 portador de tumores TC-1.

La Fig. 5 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de E6 producidas por el tratamiento con tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6 portador de tumores TC-1.

La Fig. 6 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de los efectos antitumorales terapéuticos producidos por el tratamiento con simulado, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLC en un modelo de ratón C57BL/6 portador de tumores TC-1 como modelo terapéutico.

Mejor modo De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un polipéptido de fusión de E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH) , un péptido señal para secretar el polipéptido en la célula y un péptido inmunopotenciador para un sujeto.

Las proteínas E6 y E7 constituyen el polipéptido de fusión de la presente invención son las proteínas antigénicas E6 y E7 derivadas del tipo 16 del virus del papiloma humano (VPH16) .

Como se ha descrito, la expresión “polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano” se refiere a una proteína de fusión de un polipéptido en la que cada una de E6 y E7 tiene una secuencia de aminoácidos de 35 origen natural o E6 y E7 tiene un mutante de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos naturales. Como se usa en el presente documento, el término “mutante” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos natural sometiendo al menos un residuo de aminoácidos a deleción, inserción, sustitución conservadora o una combinación de los mismos, pero tiene sustancialmente la misma inmumogeneicidad que la del polipéptido E6 y E7 naturales y se puede producir de forma natural o artificial. 40 En la invención, los mutantes se definen como codificados por la SEC ID Nº 3, en la que las... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión, que comprende -un polipéptido de fusión de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano, en el que

(1) la sección de la proteína E6 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 3, y

(2) la sección de la proteína E7 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 5, -un péptido señal para secretar el polipéptido hacia fuera de la célula, y -un péptido inmunopotenciador elegido del grupo que consiste en un ligando de CD40 y un ligando de Flt3.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido señal es el péptido señal secretor de tPa.

3. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, que comprende la secuencia de aminoácido.

10. codificada por la SEC ID Nº 7.

4. La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que -el péptido inmunopotenciador es un ligando de Flt3 codificado por la SEC ID Nº 15, o -el péptido inmunopotenciador es un ligando de CD40 codificado por la SEC ID Nº 17.

5. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5.

7. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6,

-en el que la secuencia que codifica el polipéptido de fusión de E6 y E7 está optimizado por codones para un mamífero para incrementar la tasa de expresión génica y/o

-en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido inmunopotenciador está optimizado por 20 codones para un mamífero para incrementar la tasa de expresión génica y/o

-en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el señal está optimizada por codones para un mamífero para incrementar la tasa de expresión génica.

8. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y

-la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y/.

25. el vector recombinante de la reivindicación 6.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 o una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, -para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, y/o

-para su uso en el tratamiento y/o prevención del cáncer cervicouterino. 30