PROTEINA PSAA LIPIDADA RECOMBINANTE, PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION Y UILIZACION.

Molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína distinta a PsaA y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína madura PsaA,

o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la secuencia señal de la lipoproteína contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W9900379US.

Solicitante: CENTERS FOR DISEASE CONTROL & PREVENTION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1600 CLIFTON ROAD, N.E., MAILSTOP: G16,ATLANTA, GA 30333.

Inventor/es: HUEBNER, ROBERT, C., ADES,EDWIN,W, CARLONE,GEORGE,M, DE,BARUN,K, SAMPSON,JACQUELYN,S.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 7 de Octubre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/315B

Clasificación PCT:

  • A61K39/02 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Antígenos bacterianos.
  • A61K39/09 A61K 39/00 […] › Streptococcus.
  • C07K14/315 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Streptococcus (G), p. ej. Enterococci.
  • C12N15/31 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.

Clasificación antigua:

  • A61K39/02 A61K 39/00 […] › Antígenos bacterianos.
  • A61K39/09 A61K 39/00 […] › Streptococcus.
  • C07K14/315 C07K 14/00 […] › de Streptococcus (G), p. ej. Enterococci.
  • C12N15/31 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.

Fragmento de la descripción:

Proteína PsaA lipidada recombinante, procedimientos de preparación y utilización.

Antecedentes de la invención

El microorganismo Streptococcus pneumoniae es una importante causa de otitis media, meningitis, bacteriemia y neumonía, y uno de los principales causantes de infecciones mortales en personas mayores o en personas con afecciones médicas subyacentes, tales como enfermedad pulmonar, enfermedad hepática, alcoholismo, célula falciforme, fisuras de líquido cerebroespinal, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), y pacientes sometidos a una terapia de inmunodepresión. También es una de las principales causas de morbilidad en niños de corta edad. Las infecciones neumocócicas provocan aproximadamente 40.000 muertes anuales en los Estados Unidos (CDC. Prevention of Pneumococcal Disease. MMWR 1997;46:1-25). Las infecciones neumocócicas más graves implican meningitis invasiva e infecciones de bacteriemia, con 3.000 y 50.000 casos anuales, respectivamente.

A pesar de la utilización de antibióticos y vacunas, la prevalencia de infecciones neumocócicas ha disminuido poco en los últimos 25 años; el índice de letalidad de la bacteriemia es del 15-20% en la población general, del 30-40% en los ancianos y del 36% en la población afroamericana de zonas urbanas deprimidas. Otras formas menos graves de enfermedad neumocócica son la neumonía, con 500.000 casos anuales en Estados Unidos, y la otitis media en niños, con unos 7.000.000 casos anuales en Estados Unidos causados por el S. pneumoniae. Las cepas de S. neumoniae resistentes a fármacos se están haciendo cada vez más frecuentes tanto en Estados Unidos como en el resto del mundo. En algunas zonas, la proporción de aislados neumocócicos resistentes a la penicilina llega a ser del 30%. El aumento de neumococos resistentes a antimicróbicos enfatiza aún más la necesidad de prevenir infecciones neumocócicas.

El neumococo coloniza de forma asintomática las vías respiratorias altas de individuos normales. La enfermedad suele ser el resultado de la proliferación de organismos desde la nasofaringe a otros tejidos durante acontecimientos oportunistas. La incidencia de portadores humanos varía dependiendo de la edad y las circunstancias. Las tasas de portadores suelen ser más elevadas en niños que en adultos. Diversos estudios han demostrado que la proporción de niños portadores de neumococos es del 38-60% en niños de preescolar, del 29-35% en niños de primaria y del 9-25% en niños de los primeros años de secundaria. En los adultos, la proporción de portadores cae hasta el 6% para aquellos que no conviven con niños y oscila entre el 18 y el 29% en los que sí conviven con niños. No es de extrañar que la mayor proporción de portadores en niños que en adultos vaya en paralelo con la incidencia de enfermedad neumocócica en estos grupos de población.

Una objetivo atractivo en la vacunación estreptocócica es la reducción del número de portadores en las poblaciones vacunadas y, en consecuencia, disminuir la incidencia de la enfermedad neumocócica. Se especula sobre la posibilidad de que una disminución en las tasas de portadores neumocócicos mediante vacunación pueda reducir la incidencia de la enfermedad tanto en individuos sin vacunar como vacunados. Esta "inmunidad de grupo" inducida por la vacunación contra patógenos bacterianos de las vías respiratorias altas se ha observado usando las vacunas Haemophilus influenzae tipo b conjugadas (Takala, A.K. et al., J. Infect. Dis., 1991, 164: 982-986; Takala, A.K. et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 1993, 12: 593-599; Ward, J. y col, Vaccines, S.A. Plotkin y E.A. Mortimer eds., 1994, 337-386; Murphy, T.V. et al., J. Pediatr., 1993, 122; 517-523; y Mohle-Boetani, J.C. et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 1993, 12: 589-593).

En general, se acepta que la inmunidad contra el Streptococcus pneumoniae puede ser mediada por anticuerpos específicos contra la cápsula de polisacáridos del neumococo. Sin embargo, los neonatos y los niños pequeños no son capaces de dar una respuesta inmune adecuada contra la mayoría de antígenos capsulares de polisacáridos y pueden sufrir infecciones reiteradas que impliquen el mismo serotipo capsular. Un enfoque para inmunizar niños contra una serie de bacterias encapsuladas consiste en conjugar los antígenos capsulares de polisacáridos con proteínas para hacerlos inmunógenos. Este enfoque ha funcionado, por ejemplo, con la bacteria Haemophilus influenzae de tipo b (véase la patente de Estados Unidos n.º 4.496.538 concedida a nombre de Gordon y la patente de Estados Unidos n.º 4.673.574 concedida a nombre de Anderson).

Sin embargo, se conocen más de 90 serotipos capsulares de S. pneumoniae, 23 de los cuales son responsables de entre el 85 y el 90% de la enfermedad. Para que un conjugado neumocócico de polisacárido-proteína funcione, los tipos capsulares responsables de la mayoría de las infecciones deberían hacerse convenientemente inmunogénicos. Este enfoque puede resultar difícil debido a que no todos los 23 polisacáridos incluidos en la vacuna actualmente disponible pueden hacerse inmunogénicos de forma óptima, ni siquiera en adultos.

La protección mediada por respuestas de anticuerpos de polisacáridos anticapsulares se restringe al tipo de polisacárido. Distintos tipos de polisacárido facilitan la virulencia en humanos y en otras especies de forma diferenciada. Las vacunas neumocócicas se han desarrollado mediante la combinación de los 23 polisacáridos capsulares diferentes que son representativos de los tipos prevalentes de la enfermedad neumocócica humana. Estos 23 tipos de polisacárido han sido utilizados en una vacuna neumocócica autorizada desde 1983 (D.S. Fedson, M. Musher, Vaccines, S.A. Plotkin y J.E.A. Montimer eds., 1994, 517-564). La vacuna polivalente autorizada a base de 23 polisacáridos tiene una eficacia probada de aproximadamente el 60% en la prevención de bacteriemia causada por neumococos del tipo de la vacuna en adultos sanos.

Sin embargo, la eficacia de la vacuna ha suscitado polémica y, en ocasiones, se ha cuestionado si la utilización recomendada de la misma está justificada. Se ha especulado sobre la posibilidad de que la eficacia de esta vacuna se vea afectada negativamente por el hecho de tener que combinar 23 antígenos distintos. Una cantidad elevada de antígenos combinados en una única formulación podría tener un efecto negativo en las respuestas de los anticuerpos a los tipos individuales dentro de la mezcla debido a la competencia antigénica. La eficacia también se ve afectada por el hecho de que los 23 serotipos abarcan todos los tipos serológicos asociados a portadores e infecciones humanas.

Un enfoque alternativo para proteger a los niños, y también a los ancianos, de una infección neumocócica sería la identificación de antígenos proteicos que pudieran desencadenar respuestas inmunes protectoras. Dichas proteínas podrían servir por sí mismas como vacunas o podrían ser usadas junto a conjugados satisfactorios de polisacárido-proteína o como vehículos de polisacáridos.

Russell et al. han descrito una proteína inmunógenica, común a distintas especies, a partir de la bacteria S. pneumoniae, designada "proteína neumocócica de pili A" (J. Clin. Microbiol. 28: 2191-95). Este antígeno proteico de 37 kDa también se describe en la patente US nº 5.422.427, cuyas explicaciones se incluyen íntegramente en la presente memoria. La proteína de 37 kDa, denominada anteriormente "proteína neumocócica de pili A", ha sido designada más recientemente "proteína neumocócica de superficie A" (PsaA). Para los propósitos de la presente solicitud, cada vez que se utilicen las expresiones "PsaA", "proteína neumocócica de superficie A", "proteína neumocócica de pili A" o "antígeno de 37 kDa" se entenderá que se hace referencia al antígeno proteico de S. pneumoniae caracterizado por Russell et al. (1990) y descrito en la patente de US n.º 5.422.427.

Los análisis por transferencia de puntos con un anticuerpo monoclonal dirigido a PsaA demuestran que la proteína PsaA es común a los 23 serotipos neumocócicos de la vacuna (Russel et al., 1990). El gen que codifica la proteína PsaA ha sido clonado y secuenciado (Sampson et al. [1994], "Cloning and nucleotide sequence analysis of psaA, the Streptococcus pneumoniae gene encoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reported Streptococcus sp. adhesins", Infect. Immun., 62:319-324). Desgraciadamente, la cepa desde la que...

 


Reivindicaciones:

1. Molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína distinta a PsaA y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína madura PsaA, o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la secuencia señal de la lipoproteína contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico.

2. Molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal es la secuencia señal de una proteína OspA de una especie de Borrelia.

3. Molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 2, en la que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están acopladas en una relación de traducción de marco de lectura abierto.

4. Vector de expresión que contiene la molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 1 unida funcionalmente a un promotor para la expresión de la proteína madura PsaA.

5. Procedimiento de preparación de la proteína PsaA lipidada recombinante, cuyo procedimiento comprende: introducir el vector de expresión según la reivindicación 4 en un organismo huésped; y efectuar la expresión de la proteína PsaA madura desde el organismo huésped.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el organismo huésped es E. coli.

7. Procedimiento para la producción de proteína PsaA lipidada recombinante, cuyo procedimiento comprende: construir una molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína de Borrelia y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína PsaA madura, o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la secuencia señal de la lipoproteína de Borrelia contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico; formar un vector de expresión que contiene la molécula híbrida de ácido nucleico unida funcionalmente a un promotor para la expresión de la proteína madura; introducir el vector de expresión en un organismo huésped; provocar la expresión de la proteína PsaA lipidada recombinante por el organismo huésped; lisar las células del organismo huésped; tratar las células lisadas con un agente tensoactivo que solubiliza de forma selectiva la lipoproteína recombinante antes que proteínas bacterianas u otras proteínas y que es capaz de lograr la separación de fase de una fase de detergente en condiciones suaves; provocar la separación de fase en una fase de detergente que contiene proteína PsaA lipidada recombinante solubilizada, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas y otras proteínas y una fase sólida que contiene residuo celular; separar y recuperar la fase de detergente de la fase sólida y la fase acuosa; poner en contacto la fase de detergente con una primera columna cromatográfica en condiciones que conducen a la unión de una proteína diferente a la proteína PsaA lipidada recombinante a la columna para proporcionar una proteína PsaA lipidada que contiene corriente paralela de la primera columna cromatográfica y recuperar la corriente paralela de la primera columna cromatográfica; poner en contacto la corriente paralela de la primera columna cromatográfica con una segunda columna cromatográfica en condiciones que conducen a la unión de la proteína PsaA lipidada recombinante con preferencia a proteínas contaminantes y lipopolisacáridos que fluyen a través de la segunda columna cromatográfica; eluir la proteína PsaA lipidada recombinante de la segunda columna cromatográfica para proporcionar un eluyente sustancialmente libre de lipopolisacáridos y proteínas contaminantes; y recuperar el eluyente.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el agente tensoactivo es TRITONTM X-114.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el tratamiento de células lisadas se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 10ºC, la mezcla resultante es tratada a una temperatura ligeramente elevada comprendida entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente 40ºC para lograr la separación de la fase de detergente, y la fase de detergente se separa de la fase acuosa mediante centrifugación.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la primera columna cromatográfica es una columna de intercambio de iones.

11. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la lisis de las células huésped se lleva a cabo mediante congelación-descongelación.

12. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la lisis de las células huésped se lleva a cabo mediante sonicación.

13. Proteína PsaA lipidada recombinante codificada por la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. Composición inmunológica que comprende la proteína PsaA lipidada recombinante según la reivindicación 13.

15. Composición inmunológica según la reivindicación 14, que comprende además un adyuvante.

16. Composición inmunológica según la reivindicación 15, en la que el adyuvante es alumbre.

17. Utilización de la PsaA lipidada recombinante según la reivindicación 13 para la preparación de una composición inmunológica destinada al tratamiento o a la prevención de una enfermedad neumocócica.

18. Utilización de la PsaA lipidada recombinante según la reivindicación 13 para la preparación de una composición inmunológica destinada a inmunizar un huésped contra una infección neumocócica.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que dicha composición inmunológica se administra intranasalmente.

20. Composición inmunogénica para la administración intranasal a un huésped susceptible de ser portador neumocócico para provocar una respuesta inmunológica de protección contra la colonización con Streptococcus pneumoniae en la nasofaringe, que comprende una cantidad de inmunización de PsaA lipidada recombinante, o un fragmento inmunogénico de la misma.

21. Composición según la reivindicación 20 que comprende además un adyuvante.

22. Composición según la reivindicación 21, en la que el adyuvante es alumbre.


 

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