PROTEINA DE FUSION DEL ANTICUERPO L19 CONTRA FIBRONECTINA ED-B E INTERLEUCINA 12.

Conjugado que comprende un heterodímero IL12 que tiene una primera y segunda subunidades,

en el que la primera y segunda subunidades están cada una conjugada con una molécula de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple de Fv (scFv) o un anticuerpo de dominio (dAb)

Proteína de fusión del anticuerpo L19 contra fibronectina ED-B e interleucina 12.

Esta invención se refiere a la localización de un fármaco en un sitio in vivo deseado mediante la conjugación de un elemento de unión específico para el objetivo específico. La invención está especialmente dirigida a conjugados entre IL12 y moléculas de anticuerpos para aplicaciones terapéuticas tales como la inhibición de la angiogénesis patológica, incluyendo el tratamiento del cáncer y otros tumores, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad y angiomas.

La citocina interleuquina-12 heterodimérica (IL12) es un mediador clave de la inmunidad innata y celular con una potente actividad antitumoral antimetástica [4-6]. En la actualidad (primavera de 2005) se está probando en ensayos de fase II de desarrollo clínico para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas. IL12 actúa fundamentalmente sobre las células T y NK, estimulando su actividad y la secreción de interferón-y (IFN-?) [7]. Como con muchas otras citocinas, sin embargo, la administración de IL12 humana recombinante se asocia con toxicidad severa, incluso en dosis tan bajas como 1 µg/kg/día [8, 9], lo que limita su desarrollo como medicamento contra el cáncer.

Una entrega marcada de IL12 al ambiente tumoral puede utilizarse para aumentar el índice terapéutico de la citocina.

Los científicos en Lexigen han descrito la fusión de citocinas tales como IL2 e IL12 en inmunoglobulinas para marcar específicamente las citocinas [17, 49-51]. Sin embargo, nosotros, los presentes inventores, creemos que existen limitaciones en estas aproximaciones. Reconocemos que las fusiones de IgG-citocinas son en realidad proteínas multifuncionales, por lo que, además de la actividad de unión de antígenos y de citocinas, estas proteínas de fusión basadas en IgG pueden activar el complemento e interactuar con receptores Fc. En nuestra opinión esta es una característica no deseada de las fusiones IgG-citocinas, ya que las citocinas pueden ser llevadas en proximidad de las células (tales como macrófagos, neutrófilos y células asesinas naturales) llevando receptores Fc, lo que dificulta la localización tumoral y causa la activación de células no específicas. Consideramos que es más conveniente utilizar una molécula de anticuerpo que carezca de Fc, tal como un fragmento de anticuerpo de cadena única Fv (scFv), en lugar de la inmunoglobulina completa.

Previamente hemos demostrado en modelos de cáncer de roedores que el potencial terapéutico de IL12 puede aumentar considerablemente mediante la fusión de un polipéptido de cadena única que codifica secuencialmente las subunidades p40 y p35 de la citocina IL12 murina ("scIL12") con el fragmentos de anticuerpo Fv de cadena simple humano Fv L19 ("scFv(L19)"). ScFv(L19) ha demostrado ser capaz de marcar tumores selectivos en pacientes con cáncer [16]. L19 se une específicamente al dominio ED-B de la isoforma de fibronectina B-FN, que es uno de los mejores marcadores conocidos de angiogénesis [14, 25]. ED-B es un dominio adicional de 91 aminoácidos que se encuentra en la isoforma B-FN y es idéntico en ratón, rata, conejo, perro y hombre. B-FN se acumula alrededor de las estructuras neovasculares en tumores agresivos y otros tejidos que sufren angiogénesis, tal como el endometrio en la fase proliferativa y algunas estructuras oculares en condiciones patológicas, pero de otro modo no es detectable en tejidos adultos normales [1-3].

La proteína de fusión scFv-scIL12 (L19), mostró un índice terapéutico muy superior a scIL12 fusionado en un scFv de especificidad irrelevante en ratones, y en IL12 murina recombinante. Estos experimentos demostraron claramente el potencial de las proteínas de fusión basadas en anticuerpos de citocinas como una vía para mejorar el potencial terapéutico de IL12 [15]. El potencial terapéutico de estos resultados es considerable.

La localización de IL12 al nivel de los vasos sanguíneos del tumor, tal como mediante el uso de L19, es terapéuticamente beneficioso por una serie de razones. En primer lugar, la neovasculatura tumoral es más accesible a los agentes terapéuticos administrados por vía intravenosa que las células tumorales, lo que ayuda a evitar los problemas asociados con la hipertensión intersticial de los tumores sólidos [10]. En segundo lugar, la angiogénesis (crecimiento de nuevos capilares de los vasos sanguíneos preexistentes) es un rasgo característico de la mayoría de los tumores sólidos agresivos [11]. La localización de IL12 en la neovasculatura debería permitir la inmunoterapia de una variedad de tipos de tumores diferentes. En tercer lugar, IL12 muestra una actividad anti-angiogénica, conferida por su mediador IP-10 posterior [12, 13].

Ya hemos estudiado extensivamente el rendimiento de la localización tumoral de scIL12-scFv(L19), y también el de scFv(L19) fusionado a otra citocina antitumoral, IL2("scFv (L19)-IL2") [18]. ScFv(L19)-IL2 muestra un excelente rendimiento de localización tumoral en ratones con tumores, con relaciones tumor:sangre y tumor:órganos tan alta como 30:1 veinticuatro horas después de la inyección intravenosa. Por el contrario, la capacidad de la localización tumoral de scIL12-scFv(L19) en los mismos modelos animales es más modesto, con relaciones tumor:sangre y tumor:órganos generalmente peores de 10:1 a las 24 h, y con pobres relaciones tumor:hígado y tumor:bazo [15]. Estos resultados de localización, sin embargo, eran superiores en comparación con una proteína de fusión scFv-scIL12(HyHEL10), específica de la lisozima de huevo de gallina, pero carece de reconocimiento específico del antígeno en el ratón.

Las propiedades de localización tumoral de scFv(L19) se han mostrado que mejoran cuando scFv(L19) fue dimerizado a través de un dominio CH4 de IgE humano, creando una estructura de mini-anticuerpo, también llamada "pequeña proteína inmune" o SIP. Las propiedades de la localización tumoral de SIP(L19) se han descrito previamente [21].

La presente invención se basa en el trabajo en el que nosotros, los inventores, comparadas las capacidades de la localización de tumores de tres conjugados de IL12 y scFv(L19), cada uno con un formato diferente de la citocina y/o el anticuerpo, y se encontró que la capacidad de localización tumoral de scIL12-scFv(L19) se puede mejorar cambiando el formato del conjugado de una manera particular.

Un formato probado fue scIL12-scFv(L19), ilustrado en la figura 1A. Este conjugado mostró una modesta capacidad de localización tumoral, consistente con los resultados de la técnica anterior.

Otro formato utilizado fue la construcción dimérica SIP(L19) antes mencionada para crear un homodímero de scIL12-SIP (L19), ilustrado en la Figura 1B. Sin embargo, a pesar de la indicación de la técnica anterior que las propiedades de localización tumoral de L19 pueden mejorarse utilizando el formato SIP, no se observó una captación tumoral mayor de este conjugado.

Otro formato fue un heterodímero de las subunidades IL12 p40 y p35, en el que cada subunidad se fusionó en scFv (L19), formando un heterodímero scFv(L19)-p35/p40-scFv(L19) como se ilustra en la figura 1C. Con este formato heterodimérico logramos una notable mejora en la captación tumoral del conjugado.

Así, hemos descubierto que un nuevo formato de proteína de fusión con anticuerpo IL12, que consiste en dos fragmentos scFv heterodimerizados a través de las subunidades p40 y p35 de IL12, mantiene la actividad completa de IL12 y muestra una excelente capacidad de localización tumoral.

Estos resultados tienen importantes implicaciones terapéuticas para mejorar la localización de IL12 en tumores y en otros sitios de angiogénesis patológica, por ejemplo, para el tratamiento de artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad y angiomas. La utilidad de esta invención se extiende no sólo a la fusión de IL12 y scFv(L19), sino también a conjugados entre otros miembros de unión específica y otros fármacos y sustancias. Por ejemplo, los conjugados pueden construirse con elementos de unión específicos diferentes de scFv(L19) conjugados a subunidades IL12, tales como otros fragmentos de anticuerpos específicos para los antígenos asociados a tumores, por ejemplo isoformas de tenascina-C, y se utilizan para localización tumoral y terapia del cáncer. Las implicaciones más amplias también incluyen una variedad de otros usos que implican la localización de sustancias in vivo, procedimientos de diagnóstico, así como la prevención...

1. Conjugado que comprende un heterodímero IL12 que tiene una primera y segunda subunidades, en el que la primera y segunda subunidades están cada una conjugada con una molécula de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple de Fv (scFv) o un anticuerpo de dominio (dAb).

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la primera y segunda subunidades de la proteína heterodimérica están enlazadas covalentemente a través de una unión de disulfuro.

3. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple de Fv (scFv).

4. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo de dominio simple (dAb).

5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera subunidad se conjuga a la molécula de anticuerpo como una primera proteína de fusión, y la segunda subunidad se conjuga a la molécula de anticuerpo como una segunda proteína de fusión.

6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el conjugado tiene un peso molecular de 250.000 o menos.

7. Conjugado según la reivindicación 6, en el que el conjugado tiene un peso molecular de 150.000 o menos.

8. Conjugado según la reivindicación 7, en el que el conjugado tiene un peso molecular de 120.000 o menos.

9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las dos moléculas de anticuerpo son idénticas.

10. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 9, que comprende un conjugado heterodímero IL12 humano a y entre dos moléculas de anticuerpo scFv o dAb; en donde

el heterodímero IL12 tiene una primera y una segunda subunidades;

la primera subunidad se conjuga en una molécula de anticuerpo scFv o dAb como una primera proteína de fusión; y

la segunda subunidad se conjuga en una molécula de anticuerpo scFv o dAb como una segunda proteína de fusión.

11. Conjugado según la reivindicación 10, en el que las dos moléculas de anticuerpo son scFv.

12. Conjugado según la reivindicación 10, en el que las dos moléculas de anticuerpo son dAbs.

13. Conjugado según la reivindicación 11, en el que la primera proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 1.

14. Conjugado según la reivindicación 10 o la reivindicación 13, en el que la segunda proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 2.

15. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que una o dos moléculas de anticuerpo se unen específicamente a un componente de matriz extracelular asociada con crecimiento neoplásico y/o angiogénesis.

16. Conjugado según la reivindicación 15, en el que el componente de matriz extracelular es fibronectina ED-B.

17. Conjugado según la reivindicación 16, en el que la molécula de anticuerpo es scFv(L19) que tiene un dominio VH que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, y un dominio VL que comprende la secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30.

18. Conjugado según la reivindicación 17, en el que la molécula de anticuerpo es scFv(L19) que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 5.

19. Conjugado según la reivindicación 15, en el que el componente de matriz extracelular es una isoforma de tenascina-C.

20. Conjugado según la reivindicación 19, en el que la molécula de anticuerpo es scFv(TN11) que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 21.

21. Procedimiento de producción de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 20, que comprende:

expresar la primera y segunda proteínas de fusión; y

conjugar la primera y segunda subunidades para formar el heterodímero IL12.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende expresar la primera y segunda proteínas de fusión en una célula que contiene ácido nucleico que codifica las dos proteínas de fusión.

23. Procedimiento según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, que también comprende formular el conjugado en una composición farmacéutica.

24. Composición que comprende

una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende una molécula de anticuerpo scFv o dAb y una subunidad p40 IL12; y

una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende una molécula de anticuerpo scFv o dAb y una subunidad p35 IL12.

25. Composición según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es un scFv.

26. Composición según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es un dAb.

27. Composición según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.

28. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en la que la primera y segunda moléculas de ácido nucleico son un primer y segundo vectores.

29. Célula huésped que contiene una primera y una segunda molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28.

30. Composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

31. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

32. Conjugado según la reivindicación 31 para su uso en la inhibición de la angiogénesis y/o el crecimiento neoplásico en un paciente.

33. Conjugado según la reivindicación 32 para su uso en el tratamiento de un tumor, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad o angioma.

34. Utilización de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 en la fabricación de un medicamento para inhibir la angiogénesis y/o el crecimiento neoplásico en un paciente.

35. Utilización según la reivindicación 34, en el que el medicamento es para tratar un tumor, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad o angioma.