Proteasas.

Polipéptido aislado con actividad de proteasa, que muestra i) una actividad relativa a 15ºC y pH 9 de al menos 0,

8,

ii) una actividad relativa a 25ºC y pH 9 de al menos 0,10; y/o una actividad relativa a 37ºC y pH de al menos 0,20 donde la actividad se compara con la actividad a óptima temperatura de la misma proteasa; seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para aminoácidos 1- 192 de la SEC ID nº: 4 o aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº:6 de al menos un 80%; y

(b) un fragmento de (a) que tiene actividad de proteasa.

Proteasas

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de proteasa y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped, incluyendo células de plantas y animales, comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos, al igual que métodos para producción y uso de los polipéptidos, en particular, el uso de los polipéptidos en alimento para animales y detergentes.

Antecedentes de la invención

[0002] Proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 se describen en la WO 88/03947. El ADN y secuencias de aminoácidos de la proteasa derivados de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 se muestran en DK aplicación n° 1996 00013. La WO 01/58276 divulga el uso en alimento para animales de proteasas de ácido estables relacionadas con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, al igual que una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010.

[0003] La JP 2-255081-A divulga una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. cepa OPC-210 (FERM P-10508), sin embargo, sin información de secuencia. La cepa ya no está disponible, ya que el depósito se retiró.

[0004] La DD 200432|8 divulga una preparación proteolítica derivada de Nocardiopsis dassonvillei cepa ZIMET 43647, sin embargo, sin información de secuencia. La cepa parece no estar ya disponible.

[0005] La JP 2003284571-A divulga la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiente de una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM P-18676). La secuencia se ha introducido en GENESEQP con n° ADF43564.

[0006] Es un objeto de la presente Invención proporcionar proteasas alternativas, en particular, para uso en alimento

para animales y/o detergentes.

Resumen de la invención

[0007] Varias proteasas se clonaron, purificaron y caracterizaron. Estas proteasas se designan de la siguiente manera: proteasa L1a derivadas de Nocardiopsis dassonvilleisubesp. dassonvillei DSM 43235 (ver SEC ID n° 1 y 2); proteasa L1b derivada de Nocardiopsis prasina DSM 15649 (ver SEC ID n°: 3 y 4); proteasa L1c derivada de Nocardiopsis prasina (previamente alba) DSM 14010 (ver SEC ID n°: 5 y 6); proteasa L2a derivada de Nocardiopsis sp. DSM 16424 (ver SEC ID n°: 7 y 8); proteasa L2b derivada de Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (ver SEC ID n°: 9 y 10); y proteasa L2c derivada de Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (ver SEC ID n°: 11 y 12).

[0008] La presente invención se refiere a:

Un polipéptido aislado con actividad de proteasa, que muestra i) una actividad relativa a 15°C y un pH 9 de al menos 0,8, ii) una actividad relativa a 25°C y un pH 9 de al menos 0,10; y/o iii) una actividad relativa a 37°C y un pH 9 de al menos 0,20, donde la actividad se compara a la actividad a la temperatura óptima de la misma proteasa; seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para aminoácidos 1-192 de la SEC ID n°: 4 o aminoácidos 1-192 de la SEC ID n° 6 de al menos 80%; y

(b) un fragmento de (a) que tiene actividad de proteasa.

[0009] La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos anteriores y a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos al Igual que métodos para producción y uso de los polipéptidos, en particular, en alimento para animales y detergentes.

Descripción detallada de la invención

Polipéptidos con actividad de proteasa

[0010] Polipéptidos con actividad de proteasa, o proteasas, se designan también a veces también peptldasas, protelnasas, hldrolasas peptídlcas o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidrolizan péptldos empezando en cualquier extremo de estos, o del tipo endo que actúan internamente en las cadenas

polipeptídicas (endopeptidasas). Endopeptidasas muestran actividad en sustratos de péptido bloqueados N- y C- terminalmente que son pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

[0011] El término "proteasa" se define aquí como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier enzima que pertenece al grupo enzimático EC 3.4 (incluyendo cada una de las trece subclases de esta). El número EC se refiere a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academlc Press, San Diego, California, Incluyendo suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650 respectivamente. La nomenclatura es regularmente complementada y actualizada; ver, por ejemplo, la World Wide Web (WWW) en http: //www. chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

[0012] Las proteasas se clasifican basándose en sus mecanismos catalíticos en los siguientes grupos: Serina proteasas (S), Cisterna proteasas (C), Proteasas aspárticas (A), Metalo proteasas (M), y Proteasas desconocidas, o aún sin clasificar (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.

[0013] En una forma de realización particular, las proteasas se seleccionan del grupo que consiste en:

(a) proteasas del grupo enzimático EC 3.4.-.-;

(b) serina proteasas del grupo S del manual anterior;

(c) serina proteasas de la familia de peptidasa S2A; y/o

(d) serina proteasas de la familia de peptidasa S1 E como se describe en Biochem. J. 290:205-218 (1993) y en MEROPS protease database, release 6.20, March 24, 2003, ( www.merops.ac.uk ). La base de datos se describe en Rawllngs, N.D., Ó'Brlen, E. A. & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: the protease database.Nucleic Acids Res. 30, 343-346.

[0014] Para determinar si una proteasa dada es una serina proteasa, y una familia de proteasa S2A, se hace referencia al manual anterior y a los principios Indicados en este. Tal determinación puede llevarse a cabo para todo tipo de proteasas, sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o creadas genéticamente o proteasas sintéticas.

[0015] Actividad de proteasa puede medirse usando cualquier ensayo, en el que un sustrato se emplea, que incluye enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión. PH de ensayo y temperatura de ensayo se adaptan asimismo a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9,10,11,o12. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, o 95°C.

[0016] Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, como caseína entrecruzada con azurina (caseína AZCL). Tres ensayos de proteasa se describen en los ejemplos 4-5 aquí, cualquiera de los cuales se puede usar para determinar actividad de proteasa. Para los fines de esta invención, el ensayo denominado pNA es un ensayo

preferido.

[0017] No hay limitaciones en el origen de la proteasa de la invención y/o para uso según la invención. Así, el término proteasa incluye no solo proteasas naturales o de tipo salvaje obtenidas de microorganismos de cualquier género, sino también cualquier mutaciones, variantes, fragmentos etc. de estas que muestran actividad de proteasa, al igual que proteasas sintéticas, como proteasas transpuestas y proteasas de consenso. Tales proteasas creadas genéticamente se pueden preparar como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, por mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR con la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR), o por mutagénesis aleatoria. La preparación de proteínas de consenso se describe en, por ejemplo, el documento EP 897985. Transposición de genes se describe generalmente en, por ejemplo, los documentos WO 95/22625 y WO 96/00343. Recombinación de genes de proteasa puede hacerse independientemente de la secuencia específica de los progenitores por transposición sintética como se describe en Ness, J.E. et al, en Nature Biotechnology, Vol. 20 (12), pp. 1251-1255, 2002. Oligonucleótidos sintéticos degenerados en su secuencia de ADN para proporcionar la posibilidad de que todos los aminoácidos encontrados en el conjunto de proteasas progenitoras se diseñan y los genes se ensamblan según la referencia. La transposición puede llevarse a cabo para la secuencia de longitud completa o para solo parte de la secuencia y luego más tarde combinada con el resto del gen para dar una secuencia de longitud completa. Las proteasas de las SEC ID n°: 2, 4, 6, 8, 10, y 12, al... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de proteasa, que muestra i) una actividad relativa a 15°C y pH 9 de al menos 0,8, ii) una actividad relativa a 25°C y pH 9 de al menos 0,10; y/o una actividad relativa a 37°C y pH de al menos 0,20 donde la actividad se compara con la actividad a óptima temperatura de la misma proteasa; seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para aminoácidos 1- 192 de la SEC ID n°: 4 o aminoácidos 1-192 de la SEC ID n°:6 de al menos un 80%; y

(b) un fragmento de (a) que tiene actividad de proteasa.

2. Polipéptido según la reivindicación 1 que comprende cualquiera de las siguientes proteasas:

(a) aminoácidos 1-192 de la SEC ID n°: 4 o

(b) aminoácidos 1-192 de la SEC ID n°: 6

3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad de proteasa, y que

(a) codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2;

(b) tiene un grado de identidad para nucleótidos 574-1149 de la SEC ID n°: 5 de al menos un 79,3%.

4. Secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 que comprende cualquiera de las siguientes secuencias de ácido nucleico que codifican proteasa:

(a) nucleótidos 574-1149 de la SEC ID n°: 3.

(b) nucleótidos 574-1149 de la SEC ID n°: 5.

5. Construcción de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 3-4 unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

6. Vector de expresión recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 5.

7. Célula huésped recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos de la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6.

8. Planta transgénica, o parte de planta, que ha sido transformada con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. Método para la producción de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el método comprendiendo

(a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 7 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y

(b) recuperación del polipéptido.

10. Método para la producción de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el método comprendiendo

(a) cultivo de cualquiera de las cepas siguientess:

(i) Nocardiopsis prasina DSM 15649, o

(ii) Nocardiopsis prasina DSM 14010;y

(b) recuperación del polipéptido.

11. Uso de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2

(i) en alimento para animales;

(ii) en aditivos de alimento para animales;

(iii) en la preparación de una composición para uso en el alimento para animales;

(iv) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales;

(v) para aumentar la proteína soluble y/o digerible en el alimento para animales;

(vi) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales;

(vil) para el tratamiento de proteínas; y/o

(viii) en composiciones de detergente.

12. Método para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales, donde al menos un polipéptido de 10 cualquiera de las reivindicaciones 1-2 se añade al alimento.

13. Aditivo de alimento comprendiendo

(a) al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 15

(b) al menos una vitamina liposoluble, y/o

(c) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o

(d) al menos un oligoelemento.

14. Aditivo de alimento según la reivindicación 13, que comprende además amilasa; fitasa; xilanasa; galactanasa; alfa-galactosidasa; proteasa, fosfolipasa; y/o beta-glucanasa.

15. Alimento para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos una

proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.