PROMOTOR DE UN GEN DE UNA QUITANASA DEL ALGODON.

Un promotor de ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo de la SEC DE ID Nº:

7, la SEC DE ID Nº: 8, la SEC DE ID Nº: 9, y la SEC DE ID Nº: 10

Promotor de un gen de una quitanasa del algodón.

La presente invención se refiere al promotor de un gen que se expresa en células con paredes secundarias durante la deposición de la pared celular secundaria.

Las células de la fibra de algodón (Gossypium hirsutum L. y otras especies de Gossypium entre las que se incluyen G. barbadense L., G. arboreum L., y G. herbaceous L.), un cultivo de enorme importancia económica en la agricultura mundial, son células epidérmicas diferenciadas de la cubierta de la semilla. En la madurez, la célula de la fibra, considerada desde el interior al exterior, está constituida por una luz celular, la pared celular secundaria, la pared celular primaria y una cutícula cérea delgada. La pared celular primaria está constituida por compuestos pécticos, componentes de hemicelulosa, celulosa, y proteínas. La pared celular está constituida principalmente (aproximadamente el 95%) por celulosa con pequeños porcentajes de otros componentes no identificados aún de manera concluyente.

El desarrollo de la fibra de algodón está caracterizado por las etapas de iniciación, deposición de la pared celular primaria, deposición de la pared celular secundaria, y desecación. Durante la etapa de pared primaria del desarrollo de la fibra, se produce la deposición de la pared primaria para facilitar el alargamiento de la fibra. Durante la etapa de pared secundaria del desarrollo de la fibra, se produce la deposición de la pared secundaria para realizar el espesamiento de la fibra. La deposición de la pared primaria y la secundaria implica la síntesis de todos los componentes de la pared celular característicos de cada etapa y el ensamblaje de las moléculas en una pared celular organizada externa a la membrana plasmática. Se requieren muchos cientos de genes para la diferenciación y el desarrollo de la fibra de la planta. La investigación sobre las proteínas de la fibra traducidas in vitro (Delmer y col., "New Approaches to the Study of Cellulose Biosynthesis", J. Cell Sci. Suppl., 2: 33-50 (1985)), las proteínas aisladas de la fibra (Graves y Stewart, "Analysis of the Protein Constituency of Developing Cotton Fibers", J. Exp. Bot. 39: 59-69 (1988)), y el análisis de genes concretos Wilkins y col., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, p. 231-270 (1999)) sugieren claramente la expresión génica diferencial durante diversas etapas del desarrollo de la célula. Sin embargo, sólo se han identificado unos pocos de los genes implicados en la biosíntesis de gran número de proteínas, enzimas, polisacáridos, o ceras específicas de la fibra o que potencian la fibra (John y col., "Gene Expression in Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber: Cloning of the mRNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 5769-5773 (1992); John, "Characterization of a Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber mRNA (Fb-B6)", Plant Physiol., 107: 1477-1478 (1995)). Puesto que estos genes y sus interacciones con el entorno determinan la calidad de la fibra, se considera un aspecto importante su identificación y caracterización para la mejora de los cultivos de algodón.

En particular, cómo se sintetizan las paredes celulares secundarias, cómo ayudan a la función, la adaptación, y la defensa de la planta, y cómo sus propiedades se traducen en la utilidad industrial, son preguntas importantes relacionadas con los mecanismos biológicos básicos, la ecología, y la mejora de la planta. Las paredes celulares secundarias de la planta se sintetizan en algunos tipos de células especializadas para facilitar funciones concretas, tales como la conducción a largo plazo del agua (elementos traqueales), control de la respiración (células oclusivas) y dispersión de las semillas (fibras de algodón). Estas paredes celulares secundarias tienen un contenido mayor de celulosa con elevada resistencia a la tracción, que excede normalmente del 40% en peso, y son mucho más gruesas que las paredes de las células primarias. Consiguientemente, su contenido de hemicelulosa, pectina, y proteína es reducido, produciéndose la reducción más extrema en el caso de las paredes celulares secundarias de la fibra de algodón, que tienen aproximadamente un 95% de celulosa. Por otra parte, durante la deposición de la pared primaria, el contenido de celulosa es normalmente del 9-30% (p/p) (Meinert y col., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59: 1088-1097 (1977); Darvill y col., "The Primary Cell Walls of Flowering Plants", The Biochemistry of Plants. 1: 91-162 (1980); Smook, Handbook for Pulp and Paper Technologists, Vancouver, Canada: Angus Wilde Publications, p. 15 (1992)). Debido a que las paredes celulares secundarias son fuertes y representan una fuente en volumen de celulosa química, se han explotado como importantes recursos renovables, por ejemplo, en fibras de madera y algodón.

Las células de las fibras de algodón tienen dos etapas de desarrollo distintas entre las que se incluye la deposición de la pared secundaria. Muchos estudios de aumento de longitud de la fibra y del peso, morfología, composición de la pared celular, velocidades de síntesis de la celulosa, y expresión génica han confirmado el resumen de las etapas del desarrollo de la fibra presentado a continuación, y revisiones recientes contienen referencias principales que confirman estos hechos (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, Nueva York: Haworth Press, pp. 85-112 (1999); Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", en Basra ed., Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Professing", Nueva York, Nueva York: Haworth Press, pp. 1-46 (1999); Wilkins y col., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers, en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, Nueva York: Haworth Press, pp. 231-270 (1999)). Tras el inicio de la fibra mediante abombamiento de una célula epidérmica por encima de la superficie, comienza el alargamiento de la fibra. Se requiere la deposición de la pared primaria para facilitar el alargamiento de la fibra, y la deposición de la pared primaria continúa sólo durante al menos 12 días tras el inicio de la fibra. Este periodo representa exclusivamente la etapa de la pared primaria del desarrollo de la fibra. A continuación, comienza la deposición de la pared secundaria a la vez que continúa la deposición de la pared primaria, aunque normalmente a una velocidad más lenta. Esta etapa de desarrollo de la fibra representa la transición entre la deposición de la pared primaria y la secundaria, y comienza normalmente en G. hirsutum L. entre los 14 - 17 días después de la antesis (DPA). Posteriormente, cesa el alargamiento de la fibra y la deposición de la pared primaria, normalmente entre 18 - 24 DPA, y persiste exclusivamente la deposición de la pared secundaria hasta 34 - 50 DPA. La variación en el tiempo de inicio y la duración de cada fase del desarrollo de la fibra depende del cultivar de algodón y de las condiciones de la temperatura (DeLanghe, "Lint Development" en Mauney, eds., Cotton Physiology. pp. 325-349, The Cotton Foundation, Memphis, Tennessee (1986); Haigler y col., "Cultured Cotton Ovules as Models for Cotton Fiber Development Under Low Temperatures", Plant Physiol., 95: 88-96 (1991); Thaker y col., "Genotypic Variation and Influence of Diurnal Temperature on Cotton Fiber Development", Field Crops Research, 22: 129-141 (1989)). Por ejemplo, en el G. barbadense L. que crece en campo, no se produce deposición extensiva de la pared secundaria hasta después de 20 DPA, el alargamiento continúa hasta 39 DPA, y la deposición de la pared secundaria cesa a 48 DPA (Schubert y col., "Growth and Development of the Lint Fibers of Pima S-4 Cotton", Crop Sci., 16: 539-543 (1976)).

Las velocidades de síntesis de celulosa cambian de baja, a media, alta, respectivamente, en las etapas de transición de la pared primaria y la secundaria del desarrollo de la fibra (Meinert y col., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59: 1088-1097 (1977); Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers", Tesis Doctoral, Texas Tech University, Lubbock, TX, EE.UU. (1999)). Un ejemplo se encuentra en el desarrollo de fibras en óvulos de algodón cultivados a una temperatura óptima constante de 34ºC,...

1. Un promotor de ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo de la SEC DE ID Nº: 7, la SEC DE ID Nº: 8, la SEC DE ID Nº: 9, y la SEC DE ID Nº: 10.

2. Un constructo de ADN que comprende: un promotor de ADN de acuerdo con la reivindicación 1; un segundo ADN que codifica un proteína o un polipéptido heterólogo, en el que el promotor de ADN se une de manera operable a 5' en el segundo ADN para inducir la transcripción del segundo ADN; y una región reguladora 3' unida de manera operable al segundo ADN.

3. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la molécula del segundo ADN se expresa durante la deposición de la pared secundaria.

4. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las células de la pared secundaria son fibra de algodón.

5. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la molécula del segundo ADN se expresa en las fibras de algodón comenzando a los 14 a 17 DPA (días después de la antesis).

6. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula del segundo ADN se expresa en las fibras de algodón a través de la finalización de la deposición de la pared secundaria.

7. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula del segundo ADN se expresa en las fibras de algodón hasta el 40 DPA.

8. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el segundo ADN se selecciona entre el grupo constituido por celulosa sintasas heterólogas, en forma tanto normal como mutada, genes que modulan el reparto del carbono en la celulosa, genes de polímeros de proteínas o regiones de unión con la celulosa que cristalizan simultáneamente y que sintetizan polisacáridos y otros enzimas que pueden afectar las propiedades moleculares y biofísicas de la celulosa, factores de transcripción que prolongan el alargamiento del crecimiento y/o cambian el momento exacto o la extensión de la deposición de la pared secundaria; genes que afectan la síntesis de las hormonas de las plantas y cambian las propiedades de la fibra; genes de los elementos citoesqueléticos o proteínas asociadas al citoesqueleto que afectan las propiedades de la fibra; genes de las enzimas que sintetizan o modifican lípidos que cambian las propiedades de la membrana y mejoran la calidad de la fibra; genes para enzimas que, a través del aumento o la disminución de la actividad, prolongan o aumentan la extensión del crecimiento durante la deposición de la pared secundaria; genes de las proteínas o polímeros plásticos que están retenidos en la luz de la fibra o se integran en la pared celular para aumentar la resistencia de la fibra o cambiar sus propiedades textiles; genes de los enzimas biosintéticos de la matriz de la pared celular de la planta o sus proteínas reguladoras de tal manera que se podrían integrar otros carbohidratos en la pared celular y cambiar las propiedades de la fibra; genes de moléculas que confieren color a las fibras; genes de moléculas que cambian la absortividad y la resistencia de las fibras de algodón; y los genes de las moléculas de transducción de la señal que regulan los cambios entre las etapas de desarrollo de la fibra

9. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el segundo ADN es un gen que modula el reparto del carbono en la celulosa y codifica la celulosa sintasa, la sacarosa sintasa, la sacarosa fosfato sintasa, la UDPG-pirofosforilasa, la pirofosfatasa inorgánica, las hexoquinasas, y las invertasas.

10. Un sistema de expresión que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

11. Una célula huésped transformada con el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

12. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula huésped es una célula bacteriana o una célula de planta.

13. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula huésped es una célula de Agrobacterium.

14. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula huésped es una célula de planta de una planta seleccionada entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.

15. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la planta es algodón.

16. Una planta que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

17. Una planta de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la planta se selecciona entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.

18. Una planta de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la planta es algodón.

19. Una semilla de planta que comprende un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

20. Una semilla de planta de acuerdo con la reivindicación 19, en la que la planta se selecciona entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.

21. Una semilla de planta de acuerdo con la reivindicación 20, en la que la planta es algodón.

22. Un procedimiento para expresar un gen preferentemente en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria en una planta que comprende, transformar una planta con el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que las células de la pared secundaria son fibra de algodón.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la planta se selecciona entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la planta es algodón