PROFARMACOS CONJUGADOS DE ANALOGOS DE CC-1065.

Un profármaco que comprende un análogo de un fármaco citotóxico que contiene seco-ciclopropabenzoindol seleccionado entre el grupo que consiste 5 en análogos formados a partir de una primera subunidad de fórmula (I) unida covalentemente a una segunda subunidad de la fórmula (II),

(III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) o (IX) por medio de un enlace amida desde el grupo amino secundario del resto pirrol de la primera subunidad con el carboxilo C-2 de la segunda subunidad, 10 en el que la fórmula (I) es como se indica a continuación: en el que las fórmulas (II) - (IX) son como se indica a continuación: en las que R representa un enlazador capaz de conjugar dicho profármaco con un agente de unión a célula mediante un enlace disulfuro, un grupo inestable a ácido, un grupo inestable a la luz, un grupo inestable a peptidasa o un grupo inestable a esterasa; en las que cada uno de R1-R6 es independientemente hidrógeno, alquilo lineal C1-C3, metoxi, hidroxilo, amino primario, amino secundario, amino terciario o amido; y en las que R7 se selecciona entre el grupo que consiste en un piperazino carbamato, un 4piperidino-piperidino carbamato y un fosfato

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere a nuevos profármacos de agentes citotóxicos y a sus usos terapéuticos. Más específicamente, la invención se refiere a nuevos profármacos de agentes citotóxicos que son análogos de CC-1065 y que comprenden tanto un resto para el enlace químico a un agente de unión celular como un grupo protector que se escinde in vivo. Los profármacos pueden unirse químicamente a agentes de unión a célula para proporcionar agentes terapéuticos capaces de activarse y liberarse in vivo y suministrase a poblaciones de células específicas de una manera dirigida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Han aparecido muchos informes que apuntan a la dirección de células tumorales con conjugados de anticuerpos monoclonales-fármacos {Sela et al, en Immunoconjugates, págs. 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, en Targeted Drugs, págs.1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, en Antibody Mediated Delivery Systems, págs. 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, en Antibody Mediated Delivery Systems, págs. 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al, en Antibody Mediated Delivery Systems, págs. 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988); G.A. Pietersz & K.Krauer, 2 J. Drug Targeting, 183-215 (1994); R.V. J. Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs., 89-104 (1998); W.A. Blattler & R.V.J. Chari, en Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; e I. Ojima et al eds, American Chemical Society 2001}. Se han conjugado fármacos citotóxicos tales como metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C., clorambucilo, calicheamicina y maitansinoides con una diversidad de anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, las moléculas farmacológicas estaban unidas a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula transportadora intermediaria tal como albúmina de suero {Garnett et al, 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al, 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al, 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)}, dextrano {Hurwitz et al, 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al, 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al, 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986); y Shoval et al, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8276-8280 (1988)}, o ácido poliglutámico {Tsukada et al, 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984); Kato et al, 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada et al, 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)}.

Una amplia serie de enlazadores se encuentran actualmente disponibles para la preparación de dichos inmunoconjugados, incluyendo los enlazadores escindibles y los no escindibles. Sin embargo, ensayos de citotoxicidad in vitro, han revelado que los conjugados anticuerpo-fármaco casi nunca consiguen la misma potencia citotóxica que los fármacos no conjugados libres. Esto ha sugerido que los mecanismos mediante los cuales las moléculas farmacológicas se liberan de los anticuerpos conjugados son muy ineficaces. Anteriores trabajos en el área de las inmunotoxinas demostraron que los conjugados formados mediante puentes disulfuro entre anticuerpos monoclonales y toxinas de proteínas catalíticamente activas era más citotóxicos que los conjugados que contenían otros enlazadores {Lambert et al, 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al, en Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al, 48 Cancer Res. 26102617 (1988)}. Esta citotoxicidad mejorada se atribuyó a la alta concentración intracelular del glutatión reducido contribuyendo a la escisión eficaz del enlace disulfuro entre la molécula de anticuerpo y la toxina. Los primeros ejemplos de fármacos altamente citotóxicos fueron los maitansinoides y la calicheamicina de fármacos de elevada citotoxicidad que se habían unido a anticuerpos monoclonales mediante enlaces disulfuro. Se ha demostrado que los conjugados de anticuerpo de estos fármacos poseen elevada potencia in vitro y actividad antitumoral excepcional en modelos de xenoinjertos tumorales humanos en ratones {R. V. J. Chari et al., 52 Cancer Res., 127-131 (1992); C. Liu et al., 93, Proc. Natl. Acad. Sci., 8618-8623 (1996); L.M. Hinman et al., 53, Cancer Res., 3536-3542 (1993); y P.R. Hamann et al, 13, BioConjugate Chem., 40-46 (2002)}. [0004] Un candidato atractivo para la preparación de dichos conjugados citotóxicos es CC-1065, que es un potente antibiótico antitumoral aislado del caldo de cultivo de Streptomyces zelensis. CC-1065 es aproximadamente 1000 veces más potente in vitro que los fármacos anti-cancerosos comúnmente usados; tales como doxorubicina, metotrexato y vincristina {B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)}. [0005] La estructura de CC-1065 (Compuesto 1, FIG. 1A) se ha determinado por cristalografía por rayos X {Martin, D. G. et al, 33 J. Antibiotics 902-903 (1980) y Chidester, C. G., et al, 103 J. Am. Chem. Soc. 7629-7635 (1981)}. La molécula de CC-1065 consta de 3 restos pirroloindol sustituidos unidos por enlaces amida. La subunidad “A” tiene un anillo ciclopropil que contiene solamente carbonos asimétricos en la molécula. Aunque la configuración relativa de estos carbonos solamente está disponible a partir de datos de rayos X, la configuración absoluta se ha deducido como 3b-R, 4a-S, usando ADN como un reactivo quiral {Hurley, L. H. et al, 226 Science 843-844 (1984)}. Las subunidades “B” y “C” de CC-1065 son restos pirroloindol idénticos. [0006] La potencia citotóxica de CC-1065 se ha correlacionado con su actividad alquilante y su actividad intercalante de ADN o de unión a ADN. Estas dos actividades residen en partes distintas de la molécula. De esta manera, la actividad alquilante está contenida en la subunidad ciclopropapirroloindol (CPI) y la actividad de unión a ADN reside en las dos subunidades pirroloindol (FIG. 1A). [0007] Sin embargo, aunque CC-1065 tiene determinadas características atractivas como un agente citotóxico, tiene limitaciones en el uso terapéutico. La administración de CC-1065 a ratones produce una hepatotoxicidad retardada que conduce a la mortalidad 50 días después de una sola dosis intravenosa de 12,5 µg/kg {V. L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)}. Esto ha estimulado esfuerzos para desarrollar análogos que no causen toxicidad retardada y se ha descrito la síntesis de análogos más simples modelados sobre CC-1065

{M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)}. En otra serie de análogos, el resto CPI se sustituyó por un resto ciclopropabenzoindol (CBI) {D.L. Boger et al., J. Org. Chem., 55, 5823-5833, (1990), D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)}. Estos compuestos mantienen la alta potencia in vitro del fármaco parental, sin causar toxicidad retardada en ratones. Al igual que CC-1065, estos compuestos son agentes alquilantes que se unen al surco menor del ADN de una manera covalente para producir la muerte celular. Sin embargo, la evaluación clínica de los análogos más prometedores, Adozelesina y Carzelesina, ha conducido a resultados decepcionantes {B.F. Foster et al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996); I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2,1717-1723 (1996)}. Estos fármacos muestran escasos efectos terapéuticos debido a su alta toxicidad sistémica. [0008] La eficacia terapéutica de los análogos de CC-1065 puede mejorarse enormemente cambiando la distribución in vivo mediante el suministro dirigido al sitio tumoral, dando como resultado una menor toxicidad con respecto a los tejidos no diana, y por lo tanto, menor toxicidad sistémica. Para conseguir este objetivo, se han descrito conjugados de análogos y derivados de CC-1065 con agentes de unión a célula que dirigen específicamente células tumorales diana {Patentes de Estados Unidos Nº 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545}. Estos conjugados muestran típicamente alta citotoxicidad específica diana in vitro, y excepcional actividad antitumoral en modelos de xenoinjertos tumorales humanos en ratones {R.V. J. Chari et al., Cancer Res., 55,4079-4084 (1995)}. [0009] Típicamente, los agentes de unión a célula sólo son solubles en medio acuoso y habitualmente se almacenan en soluciones acuosas. Por lo tanto, estos análogos deberían poseer suficiente hidrosolubilidad para permitir la reacción eficaz con agentes de unión a célula y posterior formulación en solución acuosa. Además, para que los conjugados de agentes de unión a célula tengan una vida útil conveniente, es importante que los análogos de CC-1065 que están unidos a estos agentes de unión a célula sean estables durante un periodo de tiempo prolongado en soluciones acuosas. [0010] Los análogos de CC-1065 descritos hasta el momento (véanse, por ejemplo las FIGS 1B y 1C) sólo son poco hidrosolubles. Debido a la escasa solubilidad de los análogos...

1. Un profármaco que comprende un análogo de un fármaco citotóxico que contiene seco-ciclopropabenzoindol seleccionado entre el grupo que consiste en análogos formados a partir de una primera subunidad de fórmula (I) unida covalentemente a una segunda subunidad de la fórmula (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) o (IX) por medio de un enlace amida desde el grupo amino secundario del resto pirrol de la primera subunidad con el carboxilo C-2 de la segunda subunidad,

**(Ver fórmula)**

en el que las fórmulas (II) - (IX) son como se indica a continuación:

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

en las que R representa un enlazador capaz de conjugar dicho profármaco con un agente de unión a célula mediante un enlace disulfuro, un grupo inestable a ácido, un grupo inestable a la luz, un grupo inestable a peptidasa o un grupo inestable a esterasa; en las que cada uno de R1-R6 es independientemente hidrógeno, alquilo lineal C1-C3, metoxi, hidroxilo, amino primario, amino secundario, amino terciario o amido; y en las que R7 se selecciona entre el grupo que consiste en un piperazino carbamato, un 4piperidino-piperidino carbamato y un fosfato.

2. El profármaco de la reivindicación 1, en el que R es capaz de conjugar el profármaco con un agente de unión a célula mediante un enlace disulfuro.

3. El profármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que R1-R6 son hidrógeno.

4. El profármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R es capaz de conjugarse por medio de un enlace disulfuro y comprende un grupo tiol o un enlace disulfuro.

5. El profármaco de cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que R comprende polietilenglicol de la fórmula -(-O(CH2)2)n-, en la que n es un número entero de 2 a 1000.

6. El profármaco de la reivindicación 1, en el que R representa un enlazador capaz de conjugarse con una parte carbohidrato del agente de unión a célula por medio de un enlazador de hidrazona inestable a ácido y en el que R comprende un grupo hidrazido.

7. El profármaco de la reivindicación 1, en el que R representa un enlazador capaz de conjugarse con el agente de unión a célula por medio de un

enlazador inestable a ácido, un enlazador inestable a la luz o un espaciador peptídico y en el que R comprende un grupo amino.

8. El profármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha segunda subunidad se representa por la fórmula (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII),

(VIII) o (IX) y en el que R1-R6 son hidrógeno.

9. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-((1-clorometil)-1,2-dihidro5-[(4-metilpiperazino)carboniloxi]-3H-benzo(e)indol-3-il)carbonil]-1H-indol-5-il]5-[(3-metilditio-1-oxopropil)-amino]-1H-indolo-2-carboxamida o una sal del mismo.

10. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-((1-clorometil)-1,2-dihidro5-[(4-metilpiperazino)carboniloxi]-3H-benzo(e)indol-3-il}carbonil]-1H-indol-5-il]5-[(3-mercapto-1-oxopropil)-amino]-1H-indolo-2-carboxamida o una sal del mismo.

11. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-dihidro-5-[(4-piperidino-piperidino)carboniloxi]-3H-benzo(e)indol-3-il}carbonil]-1Hindol-5-il]-5-[(3-metilditio-1-oxopropil)-amino]-1H-indolo-2-carboxamida o una sal del mismo.

12. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-dihidro-5-[(4-piperidino-piperidino)carboniloxi]-3H-benzo(e)indol-3-il}carbonil]-1Hindol-5-il]-5-[(3-mercapto-1-oxopropil)-amino]-1H-indolo-2-carboxamida o una sal del mismo.

13. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-dihidro5-(fosfonoxi)-3H-benzo(e)indol-3-il}carbonil]-1H-indol-5-il]-5-[(3-metilditio-1ºxopropil)-amino]-1H-indolo-2-carboxamida o una sal del mismo.

14. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-dihidro5-(fosfonoxi)-3H-benzo(e)indol-3-il)carbonil}-1H-indol-5-il]-5-[(3-mercapto-1ºxopropil)-amino]-1H-indolo-2-carboxamida o una sal del mismo.

15. El profármaco de la reivindicación 8 que es (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-dihidro5-(fosfonoxi)-3H-benzo(e)indol-3-il}carbonil]-1H-indol-5-il]-5-[(15"-metilditio

4",7",10",13"-tetraoxapentadecil-1-oxopropil)-amino]-1R-indolo-2-carboxamida

o una sal del mismo.

16. (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-dihidro-5-(dibencilfosfonoxi)-3H-benzo(e)indol-3il}carbonil]-1H-indol-5-il]-5-[(3-metilditio-1-oxopropil)-amino]-1H-indolo-2carboxamida o una sal del mismo.

17. Un conjugado de profármaco que comprende un agente de unión a célula unido a uno o más de los profármacos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el agente de unión a célula es un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que contiene al menos un sitio de unión, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de un anticuerpo monoclonal que contiene al menos un sitio de unión o un anticuerpo monocatenario.

18. El conjugado de profármaco de la reivindicación 17 en el que dicho agente de unión a célula es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que contiene al menos un sitio de unión.

19. El conjugado de profármaco de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18, en el que el conjugado comprende un profármaco como se ha definido en la reivindicación 7 unido a con el agente de unión a célula por medio de un espaciador peptídico.

20. Una composición que comprende el conjugado de profármaco de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. El conjugado de profármaco de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18 para su uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita.

22. Un método para inhibir el crecimiento de las poblaciones de células seleccionadas in vitro o ex vivo que comprende poner en contacto una población de células o un tejido que se supone que contiene células de dicha población de células seleccionadas con una cantidad citotóxica del conjugado de la reivindicación 17 o la reivindicación 18 o la composición de la reivindicación 20.