Producción de proteína recombinante en una célula humana.

Un método para producir una proteína de interés, comprendiendo el método:

a) proporcionar uno o más vectores adenovirales recombinantes que comprenden ácido nucleico que codifica la proteína de interés bajo el control de un promotor, teniendo dichos uno o más vectores adenovirales deleciones en las regiones E1 y E2A del genoma de adenovirus,

b) propagar dichos uno o más vectores adenovirales en células PER.C6 que expresan proteína E2A (células PER.C6/E2A), para obtener partículas adenovirales recombinantes,

c) infectar un cultivo de células PER.C6 con dichas partículas adenovirales recombinantes, para producir la proteína de interés, y

d) recoger la proteína de interés.

Producción de proteína recombinante en una célula humana La invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Así, la invención tambien se refiere al campo de la producción de proteínas recombinantes, más en particular al uso de una célula humana para la producción de proteínas. La invención también se refiere al campo de la producción de anticuerpos monoclonales, y más en particular al uso de una célula humana para la producción de anticuerpos monoclonales. La invención también se refiere al campo de la producción de proteínas virales. La invención es particularmente útil para la producción de vacunas para ayudar en la protección frente a patógenos virales para vertebrados, en particular mamíferos y especialmente humanos.

Se describen métodos y composiciones en este documento para la producción de proteínas recombinantes. La invención es particularmente útil para la producción de proteínas que requieren modificaciones post-traduccionales o 15 peri-traduccionales tales como glicosilación y plegamiento apropiado. Se ha documentado bien la expresión de proteínas recombinantes humanas en células heterólogas. Han llegado a estar disponibles muchos sistemas de producción para proteínas recombinantes, variando de bacterias, levaduras, y hongos a células de insecto, células vegetales y células de mamífero. Sin embargo, a pesar de estos desarrollos, algunos sistemas de producción aún no son óptimos, o sólo son apropiados para la producción de clases específicas de proteínas. Por ejemplo, las proteínas que requieren modificaciones post-o peri-traduccionales tales como glicosilación, γ-carboxilación, o γhidroxilación no pueden producirse en sistemas de producción procariotas. Otro problema bien conocido con los sistemas de producción procariotas es el plegamiento a menudo incorrecto del producto a producir, incluso conduciendo a cuerpos de inclusión insolubles en muchos casos. Los sistemas eucariotas son una mejora en la producción de, en particular, proteínas derivadas eucariotas, pero los sistemas de producción apropiados aún tienen varios inconvenientes. La hipermanosilación en, por ejemplo, cepas de levadura, afecta a la capacidad de las levaduras de expresar glicoproteínas apropiadamente. La hipermanosilación a menudo conduce incluso a reacciones inmunes cuando se administra a un paciente una proteína terapéutica preparada de este modo. Además, las señales de secreción de levaduras son diferentes de la señales de células de mamífero, lo que conduce a un transporte más problemático de proteínas de mamífero, incluyendo polipéptidos de humano, al medio extracelular, que a su vez da como resultado problemas con la producción continua y/o aislamiento. Se usan ampliamente células de mamífero para la producción de dichas proteínas por su capacidad para realizar modificaciones posttraduccionales extensas. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero se ha desarrollado drásticamente en los últimos años, dando como resultado, en muchos casos, una tecnología de rutina.

En particular, las células de Ovario de Hámster Chino (CHO) han llegado a ser un sistema de producción de rutina y adecuado para la generación de proteínas biofarmacéuticas y proteínas para propósitos de diagnóstico. Varias características hacen CHO muy apropiada como célula hospedadora: los niveles de producción que pueden alcanzarse en células CHO son extremadamente altos; la línea celular proporciona un sistema de producción seguro, que está libre de partículas infecciosas o tipo virus; las células CHO se han caracterizado ampliamente, aunque la historia de la línea celular original es imprecisa; las células CHO pueden crecer en suspensión hasta altas densidades en biorreactores, usando medios de cultivo libres de suero; se ha desarrollado un mutante dhfr-de CHO (clon DG-44. Urlaub et al, 1983) para obtener un sistema de selección fácil introduciendo un gen dhfr exógeno y usando metotrexato a partir de una amplificación bien controlada del gen dhfr y el transgén.

45 Sin embargo, las glicoproteínas o proteínas que comprenden al menos dos subunidades (diferentes) continúan planteando problemas. La actividad biológica de las proteínas glicosiladas puede estar profundamente influida por la naturaleza exacta del componente oligosacárido. El tipo de glicosilación también puede tener efectos significativos en la inmunogenicidad, dirección y farmacocinética de la glicoproteína. En los últimos años se han hecho avances importantes en los factores celulares que determinan la glicosilación, y se han clonado muchas enzimas glicosil transferasas. Esto ha dado como resultado una investigación dirigida al diseño metabólico de la maquinaria de glicosilación (Fussenegger et al, 1999; Lee et al, 1989; Vonach et al, 1998; Jenkins et al, 1998; Zhang et al, 1998; Muchmore et al, 1989) . A continuación se describen ejemplos de dichas estrategias.

Las células CHO carecen de una enzima α-2, 6 sialil-transferasa funcional, que da como resultado la adición 55 exclusiva de ácidos siálicos a galactosa mediante enlaces α-2, 3. Se sabe que la ausencia de enlaces α-2, 6 puede potenciar la eliminación de una proteína del torrente sanguíneo. Para abordar este problema, se han diseñado células CHO para parecerse al perfil de glicanos humano, por transfección de las glicosil transferasas apropiadas. Las células CHO también son incapaces de producir oligosacáridos de LewisX. Se han desarrollado líneas celulares CHO que expresan N-acetil-D-glucosaminiltransferasa y α-1, 3-fucosil-transferasa III humanas. En contraste, se sabe que las células de roedores, incluyendo las células CHO, producen ácido CMP-N-acetilneuramínico hidrolasa que glicosila ácidos CMP-N-acetilneuramínicos (Jenkins et al, 1996) , una enzima que está ausente en humanos. Las proteínas que realizan este tipo de glicosilación pueden producir una fuerte respuesta inmune cuando se inyectan (Kawashima et al, 1993) . La reciente identificación del gen de roedores que codifica la enzima hidrolasa probablemente facilitará mucho el desarrollo de células CHO que carecen de esta actividad y evitarán este tipo de 65 modificación de roedores.

De este modo, la técnica muestra que es posible alterar el potencial de glicosilación de células hospedadoras de mamífero por expresión de enzimas glicosil transferasas humanas. Además, aunque las estructuras de glicanos derivadas de CHO en las proteínas recombinantes pueden mimetizar las presentes en sus equivalentes humanos naturales, aún se encuentran lejos de ser idénticas. Otro problema potencial es que no todas las enzimas de glicosilación se han clonado y por tanto no están disponibles para ingeniería metabólica. La administración terapéutica de proteínas que difieren de sus equivalentes humanos naturales puede dar como resultado la activación del sistema inmune del paciente y causar respuestas no deseables que pueden afectar a la eficacia del tratamiento. Usando células no humanas pueden surgir otros problemas del plegamiento incorrecto de las proteínas que sucede durante o después de la traducción que podría ser dependiente de la presencia de las diferentes proteínas chaperonas apropiadas. Puede suceder un plegamiento aberrante, que conduce a una disminución o ausencia de actividad biológica de la proteína. Además, es de gran importancia la expresión simultánea de polipéptidos por separado que formarán juntos proteínas compuestas de las diferentes subunidades, como anticuerpos monoclonales, en cantidades relativas correctas. Las células humanas serán más capaces de proporcionar todas las facilidades necesarias para que las proteínas humanas se expresen y se procesen correctamente.

De este modo es claramente deseable tener métodos para producir proteínas recombinantes humanas que implican una célula humana que proporciona procesamiento de tupo humano uniforme como modificaciones posttraduccionales y peri-traduccionales, tales como glicosilación, que también es preferiblemente apropiado para producción a gran escala.

Por tanto, la invención proporciona un método para producir al menos una sustancia proteica en una célula que comprende una célula eucariota que tiene una secuencia que codifica al menos una proteína E1 de un adenovirus o un homólogo, fragmento y/o derivado funcional de las mismas en su genoma, que no codifica dicha célula una proteína adenoviral estructural de su genoma o una secuencia integrada en el mismo, comprendiendo dicho método 25 proporcionar dicha célula con un gen que codifica una sustancia proteica recombinante, cultivar dicha célula en un medio... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una proteína de interés, comprendiendo el método:

a) proporcionar uno o más vectores adenovirales recombinantes que comprenden ácido nucleico que codifica la proteína de interés bajo el control de un promotor, teniendo dichos uno o más vectores adenovirales deleciones en las regiones E1 y E2A del genoma de adenovirus, b) propagar dichos uno o más vectores adenovirales en células PER.C6 que expresan proteína E2A (células PER.C6/E2A) , para obtener partículas adenovirales recombinantes, c) infectar un cultivo de células PER.C6 con dichas partículas adenovirales recombinantes, para producir la proteína de interés, y d) recoger la proteína de interés.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV) . 15

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína de interés es un anticuerpo.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína de interés es eritropoyetina (EPO) .

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células PER.C6 están en suspensión.