Producción de proteínas.

Un método de selección de células transformadas positivamente que comprende:

a) suministrar células eucariotas que carecen de actividad de una proteína endógena de viabilidad celular;

b) transformar dichas células eucariotas con un constructo de ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular o al menos una porción funcional de la misma, y que codifica también una proteína de interés; y

c) cultivar dichas células eucariotas transformadas con dicho constructo de ácido nucleico bajo condiciones tales que la viabilidad celular es dependiente de la actividad normal de dicha proteína de viabilidad celular seleccionando de este modo las células positivamente transformadas,

donde la proteína de viabilidad celular es la galactoquinasa 1, donde la célula eucariota es una célula de mamífero, donde un ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular y un ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés están en una configuración bi-cistrónica con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés estando corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular, y donde dicho cultivo se efectúa en presencia de D-galactosa a una concentración de 0,25 mM a 0,5 mM.

Producción de proteínas CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de producción de proteínas que utiliza selección permanente en ausencia de drogas citotóxicas y, más en particular, a la producción de proteínas altamente puras adecuadas para aplicaciones terapéuticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se necesitan grandes cantidades de proteínas puras para la terapéutica así como para el dominio de la ciencia básica. Por ejemplo, las hormonas y los factores de crecimiento (p. ej. Insulina, hormona del crecimiento) se necesitan para uso común en todo el mundo. Por otro lado, se necesitan grandes cantidades de proteínas puras para la cristalografía de proteínas y para la determinación de la estructura tridimensional. Los avances en el campo de la biología molecular permiten la producción de grandes cantidades de proteínas mediante la sobreexpresión de polinucleótidos que codifican la proteína de interés en células huésped como son las células de bacterias, levaduras, hongos, insectos, plantas y de mamífero.

Las células huésped procariotas ofrecen unos fuertes rendimientos de producción utilizando recursos de bajo coste. Sin embargo, la expresión de las proteínas eucariotas, y especialmente de proteínas humanas, en los sistemas de expresión procariota es limitada por falta de modificaciones post-traduccionales (p. ej. glicosilación, carboxilación, o hidroxilación) y/o por el plegamiento apropiado de las proteínas expresadas, dando lugar a una acumulación de proteínas recombinantes en los cuerpos insolubles de inclusión.

Los sistemas de expresión en levaduras ofrecen ciertas ventajas frente a los sistemas procariotas ya que incluyen poderosas rutas secretoras y son capaces de realizar algunas modificaciones post-traduccionales limitadas. No obstante, la expresión en sistemas de levaduras conduce típicamente a un plegamiento incorrecto de las proteínas unidas por puentes disulfuro.

Los sistemas de expresión de mamíferos proporcionan un plegamiento correcto y unas modificaciones posttraduccionales apropiadas. Sin embargo, la expresión en células de mamífero a menudo conlleva unos bajos rendimientos proteicos. Para aumentar el rendimiento proteico se realiza una transfección estable del gen de interés (GOI) en presencia de un fármaco citotóxico (p. ej. metotexato (MTX) , antagonista del ácido fólico) y de un casete de expresión que incluye un gen que evade el efecto de la droga citotóxica [p. ej. la dihidrofolato reductasa (DHFR) ]. No obstante, debido a las grandes cantidades de drogas citotóxicas usadas durante la transfección y la expresión, las proteínas que se producen en estas condiciones a menudo están contaminadas con trazas de estas drogas y, por lo tanto, inadecuadas para uso terapéutico.

En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar un método de producción de proteínas para aplicaciones farmacéuticas libre de las limitaciones anteriores.

El ácido fólico y los folatos reducidos son vitaminas esenciales que entran en la célula de mamífero mediante el transportador de folato reducido humano (hRFC) . De la misma forma, los antagonistas del ácido fólico como el metotrexato (MTX) , un potente inhibidor de DHFR, también entran en las células de mamífero mediante la proteína RFC. La exposición de las células al metotrexato produce una deficiencia de folato y al final la muerte celular. Sin embargo, estudios anteriores demostraron que la exposición al metotrexato podía conducir a una inactivación del RFC lo que da lugar fenotipos de transporte deficiente por MTX. Además, las mutaciones inactivadoras en la región codificadora de hRFC, así como el silenciamiento del promotor del RFC (debido ante todo a la pérdida de expresión y/o función de varios factores de transcripción) y/o la metilación del promotor del hRFC suprimían la actividad de transporte del RFC y daba lugar a una resistencia a las drogas antifolato (Jansen et al., 1998; Drori et al., 2000a; Rothem et al., 2002; Rothem et al., 2003; Rothem et al., 2004 a, b; Worm et al., 2001) . Además, otros estudios demostraron que una privación de leucovorina (un folato reducido) en el medio de crecimiento libre de ácido fólico produce una notable amplificación de la expresión génica del gen de hRFC con una consecuente sobreproducción de 100 veces la actividad de transporte del MTX (Jansen et al., 1998; Dori et al., 2000a) .

La D-galactosa es una hexosa esencial que se convierte en glucosa-6-fosfato en una reacción enzimática en tres etapas que involucra a la galactoquinasa (GalK1) , la UDP-Glucosa-α-D-galactosa-1-fosfato uridiltransferasa y la fosfoglucomutasa. Estudios recientes demostraron que la ausencia de la enzima completamente funcional GalK1 causa galactosemia (Novelli and Reichardt, 2000; Timson and Reece, 2003) . Además, se ha encontrado que las células de hámster deficientes en galactoquinasa no crecen en un medio que contiene D-galactosa como única fuente de hexosa y que requieren un medio que contenga D-glucosa para el crecimiento (Schumperli et al., 1982) .

US 5.723.292 A y US 5.871.957 A se refieren a métodos para generar productos proteicos en células huésped y para seleccionar células transformadas que comprende la etapa de transformación de la célula huésped con una molécula de ADN que consta de un gen que complementa una deficiencia de la célula huésped. La célula huésped es una cepa que posee una deficiencia en una función necesaria para el crecimiento normal de la célula. El gen en

la molécula de ADN que complementa la deficiencia, por ejemplo un plásmido, sirve como un marcador de selección por el que las condiciones de crecimiento para la selección puede comprender un medio complejo convencional.

De acuerdo con la presente invención se ha encontrado que la selección permanente que usa proteínas de células viables como marcadores de selección se puede utilizar para sobreexpresar la proteína de interés en células de mamífero en un medio libre de citotóxicos y en el que las proteínas producidas por dicho método son muy adecuadas para aplicaciones farmacéuticas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de selección para células positivamente transformadas que comprende: (a) el suministro de células eucariotas que carecen de actividad de una proteína endógena de viabilidad celular; (b) la transformación de las células eucariotas con un constructo de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular o, al menos, una porción funcional de la misma así como que además codifica la proteína de interés; y (c) el cultivo de las células eucariotas transformadas con el constructo de ácido nucleico bajo condiciones como que la viabilidad celular es dependiente de la actividad de la proteína de viabilidad celular seleccionando de este modo las células positivamente transformadas, donde la proteína de viabilidad celular es la galactoquinasa 1, donde la célula eucariota es una célula de mamífero, donde el ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular y el ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés están en una configuración bi-cistrónica con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés estando corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular, y donde dicho cultivo se realiza en presencia de D-galactosa en una concentración de 0, 25 mM a 0, 5 mM.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un cultivo de células eucariotas libre de citotóxicos que comprende las células genéticamente modificadas para expresar una proteína de viabilidad celular y una proteína de interés bajo condiciones de cultivo como que la viabilidad celular es dependiente de la actividad normal de la proteína de viabilidad celular, donde la proteína de viabilidad celular es la galactoquinasa 1, donde la célula eucariota es una célula de mamífero y donde el ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular y el ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés están en una configuración bi-cistrónica con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés estando corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular, y donde dicho cultivo se realiza en presencia de D-galactosa en una concentración de 0, 25 mM a 0, 5 mM.

De acuerdo con otro aspecto aún de la presente invención, se proporciona un método de producción de una proteína de interés, que comprende: (a) la transformación de células eucariotas que carecen de actividad de una proteína endógena de viabilidad... [Seguir leyendo]

1. Un método de selección de células transformadas positivamente que comprende:

a) suministrar células eucariotas que carecen de actividad de una proteína endógena de viabilidad celular;

b) transformar dichas células eucariotas con un constructo de ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular o al menos una porción funcional de la misma, y que codifica también una proteína de interés; y

c) cultivar dichas células eucariotas transformadas con dicho constructo de ácido nucleico bajo condiciones tales que la viabilidad celular es dependiente de la actividad normal de dicha proteína de viabilidad celular seleccionando de este modo las células positivamente transformadas,

donde la proteína de viabilidad celular es la galactoquinasa 1, donde la célula eucariota es una célula de mamífero, donde un ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular y un ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés están en una configuración bi-cistrónica con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés estando corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular, y donde dicho cultivo se efectúa en presencia de D-galactosa a una concentración de 0, 25 mM a 0, 5 mM.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una hormona, una citoquina, una proteína extracelular, una proteína de adhesión celular, y una proteína de señalización celular.

3. El método de la reivindicación 2, donde dicho factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico, factor beta de crecimiento transformante, factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento I tipo insulina, factor de crecimiento II tipo insulina, interferón gamma y factor de crecimiento derivado de plaquetas.

4. El método de la reivindicación 2, donde dicha hormona se selecciona a partir del grupo que consiste en prolactina, hormona paratiroidea, gastrina, leptina, hormona del crecimiento, insulina y CG-β.

5. El método de la reivindicación 2, donde dicha citoquina se selecciona a partir del grupo que consiste en SDF-Iα, IL-7, IL-10, IL-20 e IL-19.

6. El método de la reivindicación 2, donde dicha proteína extracelular se selecciona a partir del grupo que consiste en fibrinógeno, colágeno, fibronectina, vimentina, proteína 1b asociada a microtúbulos, factor de crecimiento de las neuritas (NOF) , celulosa bacteriana (BC) y laminina.

7. El método de la reivindicación 2, donde dicha proteína de adhesión se selecciona a partir del grupo que consiste en proteínas de adhesión celular que incluyen integrina, molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) , N-CAM, cadherina, tenascina, gicerina y la proteína inducida por daño nervioso 2 (ninjurin2) .

8. El método de la reivindicación 2, donde dicha proteína de señalización celular se selecciona a partir del grupo que consiste en proteína quinasa p38 activada por mitógenos, factor nuclear kappaB, proteína inhibidora de la Raf quinasa (RKIP) , Raf-1, MEK, proteína quinasa C (PKC) , fosfoinosítido-3-quinasa gamma, receptor de tirosinquinasas, proteínas G heterotriméricas, caveolina-3 y las proteínas 14-3-3.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicho constructo de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO:3.

10. El método de la reivindicación 1, donde una concentración de dicha D-galactosa es 0, 25 mM.

11. Un cultivo celular de células eucariotas libre de citotóxicos que comprende las células genéticamente modificadas para expresar una proteína de viabilidad celular y una proteína de interés bajo condiciones de cultivo tales que la viabilidad celular depende de la actividad normal de dicha proteína de viabilidad celular, donde la proteína de viabilidad celular es la galactoquinasa 1, donde la célula eucariota es una célula de mamífero y donde el ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular y un ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés están en una configuración bi-cistrónica con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés estando corriente abajo la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular, y donde dicho cultivo se efectúa en presencia de D-galactosa a una concentración de 0, 25 mM a 0, 5 mM.

12. El cultivo celular de la reivindicación 11, donde dicha proteína de interés se selecciona a partir del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una hormona, una citoquina, una proteína extracelular, una proteína de adhesión celular, y una proteína de señalización celular.

13. El cultivo celular de la reivindicación 12, donde dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico, factor beta de crecimiento transformante, factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento I tipo insulina, factor de crecimiento II tipo insulina, interferón gamma y factor de crecimiento derivado de plaquetas.

14. El cultivo celular de la reivindicación 12, donde dicha hormona se selecciona a partir del grupo que consiste en prolactina, hormona paratiroidea, gastrina, leptina, hormona del crecimiento, insulina y CG-β.

15. El cultivo celular de la reivindicación 12, donde dicha citoquina se selecciona a partir del grupo que consiste en SDF-Iα, IL-7, IL-10, IL-20 e IL-19.

16. El cultivo celular de la reivindicación 12, donde dicha proteína extracelular se selecciona a partir del grupo que consiste en fibrinógeno, colágeno, fibronectina, vimentina, proteína 1b asociada a microtúbulos, factor de crecimiento de las neuritas (NOF) , celulosa bacteriana (BC) y laminina.

17. El cultivo celular de la reivindicación 12, donde dicha proteína de adhesión se selecciona a partir del grupo que consiste en proteínas de adhesión celular que incluyen integrina, molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) , N-CAM, cadherina, tenascina, gicerina y la proteína inducida por daño nervioso 2 (ninjurin2) .

18. El cultivo celular de la reivindicación 12, donde dicha proteína de señalización celular se selecciona a partir del grupo que consiste en proteína quinasa p38 activada por mitógenos, factor nuclear kappaB, proteína inhibidora de la Raf quinasa (RKIP) , Raf-1, MEK, proteína quinasa C (PKC) , fosfoinosítido-3-quinasa gamma, receptor de tirosinquinasas, proteínas G heterotriméricas, caveolina-3 y las proteínas 14-3-3.

19. El cultivo celular de la reivindicación 13, donde una concentración de dicha D-galactosa es 0, 25 mM.

20. Un método de producción de la proteína de interés que comprende:

a) transformar las células eucariotas que carecen de actividad de una proteína de viabilidad celular endógena con un constructo de ácido nucleico que codifica la proteína de interés y dicha proteína de viabilidad celular

o al menos una porción funcional de la misma;

b) cultivar dichas células eucariotas transformadas con el constructo de ácido nucleico bajo condiciones tales que la viabilidad celular es dependiente de la actividad normal de dicha proteína de viabilidad celular

seleccionando de este modo las células positivamente transformadas; y

c) purificar la proteína de interés a partir de dichas células positivamente transformadas o de un medio de cultivo de las mismas,

donde la proteína de viabilidad celular es la galactoquinasa 1, donde la célula eucariota es una célula de mamífero, donde un ácido nucleico que codifica dicha proteína de viabilidad celular y un ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés están en una configuración bi-cistrónica con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés estando corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de viabilidad celular, y donde dicho cultivo se efectúa en presencia de D-galactosa a una concentración de 0, 25 mM a 0, 5 mM.

21. El método de la reivindicación 20, donde dicha proteína de interés se selecciona a partir del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una hormona, una citoquina, una proteína extracelular, una proteína de adhesión celular, y una proteína de señalización celular.

22. El método de la reivindicación 21, donde dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico, factor beta de crecimiento transformante, factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento I tipo insulina, factor de crecimiento II tipo insulina, interferón gamma y factor de crecimiento derivado de plaquetas.

23. El método de la reivindicación 22, donde dicha hormona se selecciona a partir del grupo que consiste en prolactina, hormona paratiroidea, gastrina, leptina, hormona del crecimiento, insulina y CG-β.

24. El método de la reivindicación 22, donde dicha citoquina se selecciona a partir del grupo que consiste en SDF-Iα, IL-7, IL-10, IL-20 e IL-19.

25. El método de la reivindicación 22, donde dicha proteína extracelular se selecciona a partir del grupo que consiste en fibrinógeno, colágeno, fibronectina, vimentina, proteína 1b asociada a microtúbulos, factor de crecimiento de las neuritas (NOF) , celulosa bacteriana (BC) y laminina.

26. El método de la reivindicación 22, donde dicha proteína de adhesión se selecciona a partir del grupo que consiste en proteínas de adhesión celular que incluyen integrina, molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) , N-CAM, cadherina, tenascina, gicerina y la proteína inducida por daño nervioso 2 (ninjurin2) .

27. El método de la reivindicación 21, donde dicha proteína de señalización celular se selecciona a partir del grupo que consiste en proteína quinasa p38 activada por mitógenos, factor nuclear kappaB, proteína inhibidora de la Raf quinasa (RKIP) , Raf-1, MEK, proteína quinasa C (PKC) , fosfoinosítido-3-quinasa gamma, receptor de tirosinquinasas, proteínas G heterotriméricas, caveolina-3 y las proteínas 14-3-3.

28. El método de la reivindicación 22, donde dicho constructo de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO:3.

29. El método de la reivindicación 21, donde una concentración de dicha D-galactosa es 0, 25 mM.