Método para la recuperación de un polisacárido de un caldo de fermentación,

y donde la recuperación incluye:

- utilizar un detergente catiónico para precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes del sobrenadante para obtener una primera fracción de polisacárido;

- utilizar alcohol para precipitar el polisacárido de la primera fracción de polisacárido para obtener una segunda fracción de polisacárido;

- someter la segunda fracción de polisacárido a una precipitación de alcohol en presencia de un detergente aniónico, por lo cual el alcohol está presente en una concentración que es inferior a la concentración en la que el polisacárido se precipita;

- la precipitación del polisacárido de la fracción soluble utilizando alcohol para obtener un precipitado de polisacárido;

- disolver el precipitado de polisacárido y someterlo a concentración y diafiltración

Proceso para la producción de un polisacárido capsular para su uso en vacunas de conjugado.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción y recuperación de polisacáridos capsulares bacterianos y su uso para la producción de vacunas conjugadas.

Antecedentes de la invención

La primera etapa al hacer una vacuna es la de separar la actividad que produce la enfermedad, de la que induce la inmunidad. En la práctica esto significa aislar o crear un organismo, o parte de uno, que es incapaz de causar enfermedad avanzada, pero que todavía retiene los antígenos responsables de inducir la respuesta inmunitaria del huésped.

Distinguimos dos grupos principales de vacunas: las vacunas de organismo entero y vacunas de subunidades. Las vacunas de organismo entero se producen matando/inactivando o atenuando/debilitando los organismos. Las vacunas de subunidades incluyen vacunas basadas en por ejemplo antígenos de proteínas y antígenos de carbohidratos.

Las vacunas antibacterianas producidas utilizando antígenos de carbohidratos se pueden componer de un polisacárido purificado (capsular) del organismo patógeno. Ejemplos de tales vacunas son: las vacunas polisacáridas Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Neisseria meningitidis (A, C, W y Y), Salmonella tifi (VI), y Streptococcus pneumoniae (23 diferentes serotipos).

Las vacunas polisacáridas parecían no proteger a los niños menores de 2 años de edad y no inducir memoria de la célula T a largo plazo. Por lo tanto, se introdujo una nueva generación de vacunas conjugadas polisacáridas de conjugado. Las vacunas conjugadas parecían ser inmunogéneticas en niños jóvenes e inducir una memoria a largo plazo. Las vacunas conjugadas se producen principalmente al adjuntar el polisacárido a un portador de proteína.

La primera vacuna conjugada que se introdujo mundialmente se dirigió contra la Haemophilus influenzae tipo b (Hib). La Haemophilus influenzae tipo b causa pulmonía y meningitis, principalmente en niños jóvenes.

Se extiende por gotitas a través de la tos, estornudos y en condiciones de vida de superpoblación. Se estima que causa de 2 a 3 millones de casos de enfermedad cada año y aproximadamente 450.000 muertes, la gran mayoría de ellas en los países en vías de desarrollo.

Varias vacunas contra la Hib ya están en uso difundido en los países más desarrollados, donde prácticamente han erradicado la enfermedad. Las vacunas están entre las más seguras actualmente en uso. Los estudios han confirmado la eficacia de estas vacunas en países menos desarrollados, pero relativamente pocos de ellos han empezado el uso rutinario en niños. La vacuna Hib es una de las vacunas más infrautilizada debido a su coste relativamente alto en comparación con las vacunas utilizadas rutinariamente en el programa regular de inmunización infantil.

Los procesos de producción utilizados hoy en día son relativamente caros, e incluyen una larga fase de cultivo de aproximadamente 16-18 horas, véase p. ej. US 4,644,059 y el periodo para el cultivo es basado típicamente en los parámetros arbitrarios, tal como el tiempo o la densidad óptica, véase p. ej. US 4,220,717. De esta manera, no es posible compensar los cambios en condiciones del cultivo y los rendimientos sub-óptimos de polisacárido son el resultado inevitable. De forma adicional, se utilizan productos químicos fuertes tal como fenol para recuperar el polisacárido, véase p. ej. US 4,695624 y EP 0 528 635.

A fin de contribuir al objetivo de la WHO (World Health Organization) y GAVI (Global Alliance for vaccines and Immunization), para poner las vacunas conjugadas Hib a disposición de todos los niños del mundo y a fin de dar a la gente en los países en vías de desarrollo una oportunidad de acceder a la tecnología-Hib, se tiene que desarrollar, patentar y autorizar un proceso de producción relativamente simple y fácilmente ampliable a escala a estos países bajo términos razonables. La vacuna producida debe cumplir los requisitos WHO pertinentes.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1: Concentración de OD₅₉₀, pH y polirribosil ribitol fosfato (PRP) durante un cultivo de prueba en una escala de 40 1.

La Figura 2: Proceso de purificación simple de polirribosil ribitol fosfato (PRP).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un método para recuperar un polisacárido de un caldo de fermentación como en la reivindicación 1.

El método para producir el polisacárido comprende:

Una de las ventajas del método de producción del polisacárido es que los polisacáridos capsulares, es decir antígeno capsular extraído de una bacteria patógena, se puede obtener en un rendimiento elevado (aproximadamente 200-400 mg/l) en un tiempo muy corto. La optimización adicional del medio y/o método de cultivo (discontinuo alimentado (fed-batch) en vez de discontinuo (batch)) por supuesto resultará en una concentración polisacárida mucho más alta. Mientras que los métodos del estado de la técnica para producir polisacáridos capsulares requieren entre aproximadamente 16 y 18 horas de fermentación, en el presente método, la fermentación se puede completar típicamente, es decir el momento óptimo para la terminación se alcanza, dentro de entre aproximadamente 6 y 14 horas, preferiblemente se completa en aproximadamente 7, 8, 9, 10 o 11 horas. Típicamente no llevará más de aproximadamente 12 a 14 horas. Los tiempos exactos por supuesto dependen de las bacterias y cepas utilizadas y pueden diferir ligeramente dependiendo de la "condición física" de las bacterias. En este contexto, la "condición física" de las bacterias se refiere entre otros, a la calidad del inoculo y se refleja en p. ej. la duración de la fase de latencia del cultivo.

Otras ventajas del método son que el método es sencillo, reproducible y rentable y da rendimientos óptimos, incluso después de un cambio en las condiciones de cultivo. Además, las bacterias se cultivan utilizando un medio simple que no contiene componentes de origen animal, salvo la hemina. Esto da como resultado un medio limpio, que es una ventaja grande, porque la tendencia hoy día es minimizar la transferencia de enfermedad animal, tal como BSE, utilizando cuantos más medios libres de componentes animales posibles.

Otra ventaja más es que también es muy flexible, en cuanto a que, tan pronto se empieza el enfriamiento, la lisis de las células se retrasa y la cosecha del polisacárido se puede hacer en cualquier momento conveniente, siempre y cuando se empiece dentro de aproximadamente 24 horas, preferiblemente dentro de aproximadamente 8, 10, 12, 14 o 16 horas, más preferiblemente dentro de aproximadamente 2, 4 o 6 horas después de empezar el enfriamiento. El experto en la materia entenderá que cuanto más alta sea la temperatura después del enfriamiento, más rápido se tendrá que comenzar la cosecha, para obtener mejores resultados. En una forma de realización, la cosecha se empieza aproximadamente 1.5 horas después de la reducción de la temperatura. El método se perfecciona sin problemas sustanciales especialmente porque la cosecha es basada en un parámetro físico (pH) y no en algo arbitrario como p. ej. el tiempo o densidad óptica (OD). Además el método resulta en una masa de polisacárido muy estable que se puede purificar utilizando un proceso relativamente simple. El proceso de purificación se basa en el sobrenadante concentrado, por lo tanto la cantidad de materiales auxiliares es mínima. La purificación resulta en un polisacárido purificado que es estable durante un tiempo largo y que supera todos los requisitos WHO.

Los polisacáridos capsulares se pueden extraer de cualquier bacteria encapsulada, sea Gram-negativa o Gram-positiva. Ejemplos no limitativos de bacterias, que se pueden utilizar, son cepas de Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corinebacterium, Listeria, Clostridium, Haemophilus,...