Proceso para preparar un compuesto de insulina donde a) en una mezcla reactiva conteniendo al menos aproximadamente un 55%,

preferiblemente al menos aproximadamente un 60%, más preferido al menos un 70%, de agua (peso/peso), un precursor de insulina está sujeto a una escisión enzimática y, después de eso, b) el producto intermedio se acopla con un compuesto nucleófilo en la mezcla reactiva usada para la reacción de escisión enzimática con la condición de que la composición de la mezcla reactiva ha sido modificada de modo que el contenido de agua en la mezcla reactiva está en el rango de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% de agua (peso/peso), preferiblemente en el rango de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40% de agua (peso/peso), y c), si se desea, eliminando el/los grupo(s) de protección, y donde ningún aislamiento del producto intermedio se realiza entre la fase de escisión (a) y la fase de acoplamiento (b)

Proceso para preparar compuestos de insulina.

La presente invención se refiere a un proceso mejorado para la conversión de un precursor de insulina en un compuesto de insulina, opcionalmente vía un éster de insulina.

Antecedentes de esta invención

La insulina es una hormona pancreática implicada en la regulación de concentraciones de glucosa en sangre. Por ejemplo, la insulina humana, porcina, y bovina, análogos de insulina e insulinas mezcladas se dan a pacientes con diabetes mellitus insulino-dependiente para controlar sus concentraciones de glucosa en sangre.

La insulina porcina y bovina normalmente se prepara a partir de glándulas del páncreas. Insulina humana se puede, semisintéticamente, preparar a partir de insulina porcina. Alternativamente, la insulina humana, al igual que muchos análogos de insulina, se pueden preparar por ingeniería genética. Por ingeniería genética, que, por ejemplo, puede ser realizada en bacterias o en levadura, un precursor de insulina se prepara que, después de eso, debe ser convertido en el producto deseado. Esta conversión puede ser realizada en formas diferentes.

Una posibilidad es la denominada transpeptidación donde una escisión peptídica y un acoplamiento peptídico se desarrolla consecutivamente en la misma mezcla reactiva, en las mismas condiciones de reacción, véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº. 4,343,898 (Novo Industri).

Otra posibilidad es, en la primera fase, disociar el precursor de insulina, véase, por ejemplo, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 (1978), 799, después de eso, para aislar el producto intermedio y, después, ejecutar el acoplamiento deseado en otra mezcla reactiva que la usada en la primera fase, véase, por ejemplo, Nature 280 (1979), 412.

Según EP 87,238, una reacción de la transpeptidación se realiza en un sistema de solvente comprendiendo entre aproximadamente el 75% y el 97% (vol/vol) de al menos un solvente mezclable de reacción no acuoso incluyendo al menos aproximadamente un 50% (vol/vol) de butano-1,4-diol.

Según US 4,579,820, el proceso de la transpeptidación se realiza usando una enzima carboxipeptidasa de la serina L-específica, por ejemplo carboxipeptidasa Y.

Según US 4,601,979 (Nordisk Insulinlaboratorium), la transpeptidación o solamente el acoplamiento peptídico se realiza en un medio de reacción acuoso sustancialmente libre de solvente orgánico.

Según WO 83/00504 (Nordisk Insulinlaboratorium), un producto porcino fue tratado con carboxipeptidasa A, el producto de des-alanina-B30 insulina resultante fue suspendido en un alcohol inferior, y esta suspensión fue mezclada con una solución de un éster de L-treonina y tripsina. En todos los ejemplos específicos, el producto de des-alanina-B30 insulina fue aislado, bien por liofilización o por precipitación.

La reivindicación 1 en EP 264,250 se refiere a un proceso para la conversión de un precursor de insulina humana en insulina humana, donde dicho precursor se trata con tripsina o carboxipeptidasa B en un medio acuoso conteniendo un primer ión metálico seleccionado entre 60 metales y un segundo ión metálico seleccionado entre 6 metales. En J. Mol. Recognition 3 (1990), 181-186, se describe diferentes métodos para preparar compuestos de insulina incluyendo una escisión enzimática seguida de reacción del producto intermedio con un nucleófilo. El producto intermedio de la reacción de escisión tiene que ser aislado.

El objetivo de esta invención es superar o mejorar al menos algunas desventajas del estado de la técnica. Por lo tanto, no todos los objetos más detallados mencionados a continuación pueden ser completamente superados o mejorados.

Definiciones

El término "aminoácido" como se utiliza en este caso, se refiere a aminoácidos que pueden ser codificados por secuencias de nucleótidos. Análogamente, esto se aplica al término residuo de aminoácidos que es un aminoácido del cual hidroxi se ha eliminado de un grupo de carboxi y/o hidrógeno se ha eliminado de un grupo amino.

De manera similar, los términos péptido y residuo peptídico consisten en residuos de aminoácidos. Preferiblemente, el péptido no contiene más de 10 residuos de aminoácidos.

El término amida de aminoácido, como se utiliza en este caso, se refiere a un aminoácido con un grupo C carboxamida terminal opcionalmente sustituido.

El término amida peptídica, como se utiliza en este caso, se refiere a un péptido con un grupo C carboxamida terminal opcionalmente sustituido.

El término "precursor de insulina", como se utiliza en este caso, se refiere a un polipéptido que consiste en dos cadenas peptídicas (correspondientes a las cadenas A y B de insulina y, de ahora en adelante, ha designado las cadenas A y B) que, de manera similar con insulina, se conectan entre sí vía dos puentes disulfuro (de un residuo de cisteína (Cys) a otro residuo de cisteína) entre las dos cadenas peptídicas y donde, como en la insulina, hay un puente disulfuro de un residuo de cisteína en la cadena A a otro residuo de cisteína en la cadena A. En este precursor de insulina hay, al menos, una lisina o un residuo de arginina en la cadena B. Opcionalmente, en este precursor de insulina, las cadenas A y B se conectan entre sí vía una tercera cadena peptídica (correspondiente al péptido de conexión en insulina) entre el extremo C terminal de la cadena B y el extremo N terminal de la cadena A. En caso de que las cadenas A y B se conecten entre sí vía esta tercera cadena peptídica, la lisina está presente en el extremo C terminal de este tercer péptido. Opcionalmente, en este precursor de insulina, una cuarta cadena peptídica puede ser conectada al extremo N terminal de la cadena B. En caso de que esta cuarta cadena peptídica se conecte al extremo N terminal de la cadena B, la lisina está presente en el extremo C terminal de esta cuarta cadena peptídica. Además, en este precursor de insulina, hay una identidad de los residuos de aminoácidos de al menos un 80%, preferiblemente al menos un 85%, más preferido al menos un 90%, y aún más preferido al menos un 95%, en comparación con la insulina humana, con la condición de que las terceras y cuartas cadenas peptídicas no deben ser tenidas en cuentas para este cálculo. En insulina humana, hay puentes disulfuro entre Cys^A6 y Cys^A11, entre Cys^A7 y Cys^B7, y entre Cys^A20 y Cys^B19 y hay lisina en la posición B29.

El término "éster de aminoácido", como se utiliza en este caso, se refiere a un aminoácido que lleva un grupo de protección carboxi C terminal y, opcionalmente, un grupo de protección hidroxi.

El término "éster peptídico", como se utiliza en este caso, se refiere a un péptido donde al menos el grupo carboxi C terminal lleva un grupo de protección carboxi. Opcionalmente, cualquier grupo hidroxi está protegido y, opcionalmente, el grupo varepsilon-amino de cualquier residuo de lisina es derivatizado, preferiblemente con un grupo hidrofóbico, por ejemplo un grupo acilo que tiene al menos 10 átomos de carbono. Preferiblemente, el éster peptídico no contiene más de 10 residuos de aminoácidos.

El término compuesto nucleófilo, como se utiliza en este caso, se refiere a un éster de aminoácido, una amida de aminoácido, un péptido, un éster peptídico, y una amida peptídica. En cualquiera de estos ésteres de aminoácidos, las amidas de aminoácidos, péptidos, ésteres peptídicos, y amidas peptídicas, el grupo amino en cualquier grupo de lisina es, opcionalmente, derivatizado, preferiblemente con un grupo hidrofóbico, por ejemplo, un grupo acilo que tiene al menos 10 átomos de carbono.

El término "compuesto de insulina", como se utiliza en este caso, se refiere a insulina de cualquier especie tal como insulina porcina, insulina bovina, e insulina humana y sales derivadas tales como sales de zinc, y sales de protamina. Además, el término "compuesto de insulina", como se utiliza en este caso, se refiere a qué podría brevemente ser designado "análogos de insulina". Análogos de insulina, como se utiliza en este caso, se refiere a compuestos de insulina donde uno o más de los residuos de aminoácidos han sido intercambiados por otro residuo de aminoácido y/o de los cuales uno o más residuos de aminoácidos han sido delecionados y/o de los cuales uno o más residuos de aminoácidos han sido añadidos, a condición que dicho análogo de insulina tenga una actividad insulínica suficiente. Ejemplos de análogos de insulina se describen en las siguientes...

1. Proceso para preparar un compuesto de insulina donde a) en una mezcla reactiva conteniendo al menos aproximadamente un 55%, preferiblemente al menos aproximadamente un 60%, más preferido al menos un 70%, de agua (peso/peso), un precursor de insulina está sujeto a una escisión enzimática y, después de eso, b) el producto intermedio se acopla con un compuesto nucleófilo en la mezcla reactiva usada para la reacción de escisión enzimática con la condición de que la composición de la mezcla reactiva ha sido modificada de modo que el contenido de agua en la mezcla reactiva está en el rango de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% de agua (peso/peso), preferiblemente en el rango de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40% de agua (peso/peso), y c), si se desea, eliminando el/los grupo(s) de protección, y donde ningún aislamiento del producto intermedio se realiza entre la fase de escisión (a) y la fase de acoplamiento (b).

2. Proceso, según la reivindicación 1, donde la enzima usada para la fase de escisión también está presente en la fase de acoplamiento.

3. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde, antes de iniciar la reacción de acoplamiento, al menos aproximadamente un 25%, preferiblemente al menos un 50%, más preferido al menos un 75%, preferiblemente al menos un 85%, más preferido al menos un 95%, del precursor de insulina se escinde al producto intermedio.

4. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la enzima usada para la escisión enzimática es tripsina o una proteasa específica de lisilo, preferiblemente proteasa I de Achromobacter lyticus.

5. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el compuesto nucleófilo es un éster de aminoácido.

6. Proceso, según la reivindicación precedente, donde el compuesto nucleófilo es un éster de treonina.

7. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 2 reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es una amida de aminoácido.

8. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 3 reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es un péptido.

9. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 4 reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es un éster peptídico.

10. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 5 reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es una amida peptídica.

11. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, incluyendo la fase de eliminar el/los grupo(s) de protección del compuesto de insulina.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el compuesto de insulina resultante tiene treonina en la posición B30.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el compuesto resultante es insulina humana, insulina aspart, insulina lispro, insulina glargina, o insulina detemir.