Método para purificar la daptomicina, que comprende las etapas de:

a) fermentar Streptomyces roseosporus con una alimentación de ácido n-decanoico para producir daptomicina en un caldo de fermentación;

b) clarificar el caldo de fermentación para obtener una disolución clarificada;

c) someter la disolución clarificada a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una preparación de daptomicina enriquecida;

d) ajustar la preparación de daptomicina enriquecida a un pH de 2,5 a 5,0 usando un ácido para formar micelas;

e) poner en contacto la preparación de daptomicina enriquecida con una resina HP-20ss para obtener una preparación de daptomicina semipurificada en la que durante la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa e) las micelas de daptomicina se disocian a pH 6,0-7,5 para dar monómeros de daptomicina mediante la elución con alcohol isopropílico al 30-40% a pH de 3,5 a 6,5; y

f) someter la preparación de daptomicina semipurificada a cromatografía de intercambio aniónico para obtener daptomicina purificada

Proceso para la purificación de daptomicina.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de la forma altamente purificada del lipopéptido daptomicina. La presente invención también implica la formación de micelas de este lipopéptido. La presente invención también se refiere a métodos de preparación de micelas de lipopéptidos a partir de monómeros no asociados de este lipopéptido, y para convertir micelas de lipopéptidos en monómeros no asociados. La presente invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de lipopéptidos usando micelas que se ajustan fácilmente a escala para la producción comercial.

Antecedentes de la invención

El rápido aumento en la incidencia de infecciones provocadas por bacterias gram-positivas, incluyendo aquellas provocadas por bacterias resistentes a los antibióticos, ha suscitado intereses renovados en el desarrollo de novedosas clases de antibióticos. Una clase de este tipo son los antibióticos lipopeptídicos, que incluye la daptomicina. La daptomicina tiene una potente actividad bactericida in vitro frente a bacterias gram-positivas clínicamente relevantes que provocan enfermedades graves y potencialmente mortales. Estas bacterias incluyen patógenos resistentes, tales como enterococos resistentes a la vancomicina (ERV), Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), Staphylococcus aureus de sensibilidad intermedia a glicopéptidos (SAIG), estafilococos coagulasa negativos (ECN) y Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina (SPRP), para los que existen muy pocas alternativas terapéuticas. Véase, por ejemplo, Tally et al., 1999, Exp. Opin. Invest. Drugs 8:1223-1238, en lo sucesivo Tally. El efecto inhibidor de la daptomicina es un efecto rápido, bactericida dependiente de la concentración in vitro e in vivo, y un efecto después del antibiótico dependiente de la concentración relativamente prolongado in vivo.

Baltz describe la daptomicina en Biotechnology of Antibiotics, 2ª Ed., editor W.R. Strohl (Nueva York: Marcel Dekker, Inc.), 1997, págs. 415-435, en lo sucesivo en el presente documento Baltz. La daptomicina, también conocida como LY 146032, es un antibiótico lipopeptídico cíclico que puede derivarse de la fermentación de Streptomyces roseosporus. La daptomicina es un miembro de los antibióticos de tipo factor A-21978C₀ de S. roseosporus y está compuesta por una cadena lateral de decanoílo unida al triptófano N-terminal de un péptido cíclico de 13 aminoácidos (figura 1). La daptomicina tiene un excelente perfil de actividad porque es sumamente eficaz frente a la mayoría de bacterias gram-positivas; es sumamente bactericida y de acción rápida; tiene una baja tasa de resistencia y es eficaz frente a los organismos resistentes a los antibióticos. En la actualidad, el compuesto está desarrollándose en una variedad de formulaciones para tratar infecciones graves provocadas por bacterias, incluyendo, pero sin limitarse a, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) y enterococos resistentes a vancomicina (ERV).

Varias patentes estadounidenses describen los antibióticos A-21978C y derivados de los mismos, incluyendo daptomicina (LY 146032) así como métodos de producción y aislamiento de los antibióticos A-21978C y derivados de los mismos.

Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.333, de nuevo examen 32.455 y 4.800.157 describen un método de síntesis de daptomicina cultivando Streptomyces roseosporus NRL15998 en condiciones de fermentación aerobia sumergida. La patente estadounidense 4.885.243 describe un método mejorado de síntesis de daptomicina alimentando a un cultivo de fermentación un ácido graso decanoico o éster o sal del mismo.

Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.310, de nuevo examen 32.311, 4.537.717, 4.482.487 y 4.524.135 describen métodos de desacilación del antibiótico A-21978C y reacilación del núcleo peptídico y derivados antibióticos preparados mediante este procedimiento. Todas estas patentes describen un núcleo de antibiótico A-21978C desacilado purificado o un derivado del mismo que se aisló del caldo de fermentación mediante filtración y, luego, se purificó mediante cromatografía en Diaion HP-20 y cromatografía en gel de sílice/C18.

Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.333 y de nuevo examen 32.455 dan a conocer un método de purificación en el que un filtrado de todo el caldo de fermentación se purificó a través de varias etapas de precipitación y de extracción para obtener un complejo crudo de A-21978C. El complejo crudo se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico en IRA-68 y dos series de cromatografía en gel de sílice. Los factores A-21978C individuales se separaron mediante gel de sílice en fase inversa o gel de sílice/C18. Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.333 y de nuevo examen 32.455 también dan a conocer que puede purificarse A-21978C mediante cromatografía discontinua usando resina de Diaion HP-20 seguida de cromatografía en columna de gel de sílice.

La patente estadounidense 4.874.843 describe un método de purificación de daptomicina en el que se filtró el caldo de fermentación y se hizo pasar a través de una columna que contenía resina HP-20. Tras la elusión, la daptomicina semipurificada se hizo pasar a través de una columna que contenía HP-20ss, y después se separó de nuevo en resina HP-20. La patente '843 afirma que la resolución final y la separación de daptomicina de compuestos estructuralmente similares mediante este método se ven impedidas por la presencia de impurezas que no pueden identificarse mediante análisis por ultravioleta del caldo de fermentación. La patente '843 afirma también que los intentos por retirar estas impurezas mediante cromatografía en fase inversa sobre gel de sílice, cromatografía en fase normal sobre gel de sílice o cromatografía de intercambio iónico también fallaron en mejorar significativamente la pureza de la daptomicina. La patente '843 también da a conocer un método inverso para la purificación, que comprende las etapas de poner en contacto una disolución acuosa del producto de fermentación con una resina no funcionalizada en fase acuosa, eliminar físicamente el agua de la resina cargada, rehumectar la resina cargada con un disolvente orgánico polar, lavar la resina con el disolvente orgánico, eluir el producto de fermentación de la resina aumentando la polaridad del disolvente y recuperar el producto de fermentación. La patente '843 enseña que este método mejora la pureza final desde aproximadamente el 80% hasta aproximadamente el 93% y aumenta el rendimiento desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 35%; sin embargo, la patente '843 no da a conocer el tipo de impurezas presentes en la preparación de daptomicina.

La patente estadounidense 5.912.226 describe la identificación y el aislamiento de dos impurezas producidas durante la fabricación de daptomicina. La daptomicina, un péptido de a-aspartilo, se transpeptida para formar un producto intermedio estable en el que el grupo aspartilo pasa a ser un grupo anhidro-succinimido (figura 2). La patente '226 enseña que la presencia de este producto intermedio, denominado anhidro-daptomicina, es más pronunciada a pH 4-6. La rehidratación de la forma de anhidro-succinimido produce un segundo producto de degradación que contiene un grupo ß-aspartilo y se denomina la forma de isómero ß de daptomicina (figura 3).

La patente '226 da a conocer que el derivado t-BOC de anhidro-daptomicina puede aislarse mediante cromatografía sobre columna de gel de sílice/C18 en fase inversa, precipitarse y volver a purificarse mediante cromatografía en gel de sílice/C18 en fase inversa. La patente '226 también enseña que la forma de isómero ß de daptomicina puede purificarse mediante cromatografía sobre una resina Diaion HP-20ss, desalarse mediante cromatografía sobre una resina Diaion HP-20 y purificarse adicionalmente usando una columna C-18 en fase inversa seguida de una columna con resina HP-20 en modo inverso.

Kirsch et al. (Pharmaceutical Research, 6:387-393, 1989, en lo sucesivo en el presente documento Kirsch) afirmaron que se produjeron anhidro-daptomicina y el isómero ß en la purificación de daptomicina. Kirsch describió métodos para minimizar los niveles de anhidro-daptomicina y el isómero ß a través de la manipulación de las condiciones de pH y las condiciones de temperatura. Sin embargo, Kirsch no pudo estabilizar...

1. Método para purificar la daptomicina, que comprende las etapas de:

2. Método según la reivindicación 1, en el que la alimentación de ácido n-decanoico en la etapa a) se regula para lograr una concentración residual de ácido n-decanoico de no más de 50 partes por millón (ppm) durante la fermentación.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de clarificación b) comprende filtración o centrifugación y filtración en profundidad.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio aniónico en la etapa c) se lleva a cabo en resina FP-DA 13.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio aniónico en la etapa f) se lleva a cabo en resina FP-DA 13.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio aniónico en la etapa f) se usa para reducir el nivel de disolvente de la etapa b).

7. Método según la reivindicación 1, en el que el método se lleva a cabo por medio de cromatografía de flujo continuo.

8. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de filtrar o concentrar la daptomicina.

9. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de despirogenar la daptomicina usando ultrafiltración.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha despirogenación comprende las etapas de:

11. Método según la reivindicación 9, que comprende además la etapa de liofilizar la daptomicina.

12. Método según la reivindicación 1, en el que dicha clarificación en la etapa b) comprende microfiltración o centrifugación.

13. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de filtrar y concentrar la daptomicina.

14. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de separar la daptomicina enriquecida obtenida en la etapa d) de material de bajo peso molecular mediante ultrafiltración.

15. Método según la reivindicación 13, que comprende además la etapa de despirogenar la daptomicina.