PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE TRANSGLUTAMINASA.

Un método para producir transglutaminasa que comprende cultivar una bacteria corineforme que tiene un constructo de expresión genético en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de un dominio de péptido señal derivado de una bacteria corineforme se conecta al lado de aguas abajo de una secuencia promotora que funciona en una bacteria corineforme y en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural se conecta al lado de aguas abajo de dicha secuencia de ácido nucleico codificante de dicho dominio de péptido señal,

permitiendo que dicha bacteria corineforme produzca y secrete dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural, y realizar luego la escisión y eliminación de la parte proestructural de dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2000/006780.

Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 15-1 KYOBASHI 1-CHOME, CHUO-KU TOKYO 104-0031 JAPON.

Inventor/es: MATSUI, HIROSHI, YOKOYAMA, KEIICHI, UMEZAWA,Yukiko, KIKUCHI,Yoshimi, DATE,Masayo.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 29 de Septiembre de 2000.

Clasificación PCT:

  • C12N15/62 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12N9/48 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces peptídicos, p. ej. tromboplastina, aminopeptidasa de la leucina (3.4).
  • C12N9/52 C12N 9/00 […] › que provienen de bacterias.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

Clasificación antigua:

  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N9/10 C12N 9/00 […] › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12N9/48 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces peptídicos, p. ej. tromboplastina, aminopeptidasa de la leucina (3.4).
  • C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2372806_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a un proceso para producir transglutaminasa, por producción por secreción. La transglutaminasa se ha utilizado en gran escala para elaboración de alimentos, la fabricación de productos farmacéuticos y otros fines. Cierto número de procesos para la producción por secreción de proteínas heterólogas han sido publicados anteriormente, con inclusión de aquéllos que se describen en la revisión de la producción por secreción de una proteína heteróloga por una bacteria perteneciente al género Bacillus [Microbial. Rev., 57, 109-137 (1993)], la revisión de la producción por secreción de una proteína heteróloga por la levadura metilotrófica Pichia pastoris [Biotechnol., 11, 905-910 (1993)] y el informe acerca de la producción industrial de proteínas heterólogas por el moho perteneciente al género Aspergillus [Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988); Biotechnol., 9, 976-981 (1991)]. La transglutaminasa producida por la producción por secreción de acuerdo con una realización de la presente invención es una enzima que cataliza la reacción de transferencia de acilo de grupos -carboxilamida en la cadena peptí- dica de la proteína. Cuando la enzima se hace reaccionar con una proteína, puede producirse la formación de la reticulación -(-Glu)-Lys y el reemplazamiento de Gln con Glu por desamidación. La transglutaminasa ha sido utilizada para fabricar productos alimenticios gelificados tales como gelatina, yogur, queso o productos cosméticos y otros gelificados, y para mejorar la calidad de la carne, etc (Publicación de Solicitud Japonesa Examinada No. 1- 50382). Además, la transglutaminasa es una enzima que tiene alta utilidad industrial en el sentido de que se ha utilizado para fabricar materiales para microcápsulas termoestables, portadores para enzimas inmovilizadas, etc. Transglutaminasas derivadas de animales y de microorganismos (transglutaminasa microbiana: a la que se hace referencia en lo sucesivo como 'MTG') se han dado a conocer con anterioridad. La primera es la enzima dependiente del ion calcio que está distribuida en órganos animales, piel, sangre, etc. Los ejemplos incluyen transglutaminasa hepática de cobayo (K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898 (1988)), transglutaminasa de queratinocitos epidérmicos humanos (M.A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)), factor XIII de coagulación de la sangre humana (A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900 (1990)) y otros. En cuanto a la última, se han descubierto transglutaminasas independientes del calcio a partir de bacterias pertenecientes al género Streptoverticillium, que incluye, por ejemplo, Streptoverticillium griseocarneum IFO12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum (éste puede abreviarse en lo sucesivo como S. cinnamoneum) IFO12852, Streptoverticillium mobaraense (éste puede abreviarse en lo sucesivo como S. mobaraense) IFO13819 y otras (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (JP-Kokai) No. 64-27471). El mapeado de los péptidos y el análisis estructural de los genes han revelado que la estructura primaria de la transglutaminasa producida por estos microorganismos no compartía homología alguna con las transglutaminasas de animales (Solicitud de Patente Europea No. 0481 504 A1). Dado que la transglutaminasa derivada de microorganismos (MTG) se produce por la purificación de los cultivos de microorganismos tal como se ha descrito arriba, ha habido problemas en términos de cantidad y eficiencia y factores análogos. Se ha intentado también la producción de transglutaminasa utilizando un procedimiento de ingeniería genética. Proteínas transglutaminasa y los genes de las mismas se han publicado, por ejemplo, en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92(1994), Biochimie, 80, 313-319(1998), Eur. J. Biochem, 257, 570-576(1998), WO 96/06931, WO 96/22366, etc , que informan de la expresión y producción de transglutaminasa en sistemas hospedador-vector tales como Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae y Escherichia coli. Además de esta información, se ha publicado un proceso en el cual se produce transglutaminasa por producción por secreción en microorganismos tales como E. coli y levadura (JP-Kokai No. 5-199883) y un método en el cual se produce MTG que posee actividades por expresión de MTG como una proteína fusionada inactiva en un cuerpo de inclusión dentro de E. coli y solubilización subsiguiente del cuerpo de inclusión utilizando agentes desnaturalizantes de proteínas, y reconstitución subsiguiente de la misma por eliminación de los agentes desnaturalizantes (JP-Kokai No. 6-30771). Sin embargo, se ha indicado el problema de que el nivel de expresión es significativamente bajo en la producción por secreción por microorganismos tales como E. coli o levadura. Por otra parte, existen ejemplos de estudios previos para la producción por secreción eficiente de proteínas heterólogas utilizando una bacteria corineforme, que incluyen la secreción de nucleasas y lipasas [US4965197, J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992)] y la secreción de proteasas tales como subtilisina [Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610- 1613 (1995)] por Corynebacterium glutamicum (éste puede abreviarse en lo sucesivo como C. glutamicum), un estudio acerca de la secreción de proteínas de la superficie celular de una bacteria corineforme [Solicitud de Patente Internacional Japonesa Publicada No. Hei 6-502548], la secreción de proteína de fijación de fibronectina utilizando este estudio [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], un informe en el cual la secreción de proteínas se mejoró utilizando una maquinaria secretora mutada [JP-Kokai No. 11-169162], etc., pero ha habido un número reducido de informes acerca de proteínas limitadas. Teniendo en cuenta la cantidad acumulada de proteínas, Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) describe que se acumulaban aproximadamente 2,5 mg/ml de proteína por 2   expresión del gen de proteasa alcalina de Dichelobacter nodosus en C. glutamicum utilizando un promotor del gen de subtilisina (aprE) de Bacillus subtilis, sitio de fijación de ribosoma y la secuencia de un péptido señal, pero US 4965197, JP-Kokai No. 6-502548 o JP-Kokai No. 11-169182 no describen específicamente los valores de la cantidad de las proteínas secretadas y acumuladas. Adicionalmente, en el caso de la proteína de fijación de fibronectina [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], únicamente se ha confirmado la acumulación secretora de la pro- teína de aproximadamente 2,5 g/l. Así pues, no ha habido informe alguno acerca de que pudi eran acumularse eficientemente proteínas heterólogas en el medio a un nivel práctico. Adicionalmente, se ha desarrollado una tecnología de ingeniería genética para una bacteria corineforme en un sistema que utiliza plásmido y fago, tal como el establecimiento de la transformación por protoplastos [J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Bacteriol., 161, 463-467 (1985)], el desarrollo de un tipo diverso de vectores [Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984); J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246(1984); Gene, 47, 301-306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69(1989)), el desarrollo del método de regulación de expresión génica [Bio/Technology, 6, 428-430 (1988)] y el desarrollo de cósmidos [Gene, 39, 281-286 (1985)]. Además, existen informes acerca de la clonación de genes a partir de una bacteria corineforme [Nucleic Acids Res., 14, 10113- 1011(1986); J. Bacteriol., 167, 695-702(1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598(1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922(1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859(1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531(1988); Mol. Microbiol., 2, 63- 72(1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339(1989); Gene, 77, 237-251(1989)]. Adicionalmente, se ha publicado también un elemento transponible derivado de una bacteria corineforme [WO93/18151; EP0445385; JP-Kokai No. 6-46867; Mol. Microbiol., 11, 739-746(1994); Mol. Microbiol., 14, 571- 581(1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397- 405(1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6(1995); JP-Kokai No. 7-107976]. El elemento transponible se refiere a un fragmento de DNA que puede transponerse en el cromosoma y se sabe que está presente en una extensa gama de organismos que van desde procariotas a eucariotas. Se han desarrollado transposones que utilizan elementos transponibles [WO 93/18151; JP-Kokai No. 7-107976; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); JP-Kokai No. 9-70291] y ha llegado a estar disponible un gen heterólogo que se expresa utilizando un transposón. Sumario de la invención Un objeto de la invención es proporcionar un proceso para la producción de transglutaminasa haciendo que una bacteria corineforme produzca transglutaminasa y liberando de modo eficiente el producto extracelularmente (es decir, por producción por secreción). Los... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.- Un método para producir transglutaminasa que comprende cultivar una bacteria corineforme que tiene un constructo de expresión genético en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de un dominio de péptido señal derivado de una bacteria corineforme se conecta al lado de aguas abajo de una secuencia promotora que funciona en una bacteria corineforme y en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural se conecta al lado de aguas abajo de dicha secuencia de ácido nucleico codificante de dicho dominio de péptido señal, permitiendo que dicha bacteria corineforme produzca y secrete dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural, y realizar luego la escisión y eliminación de la parte proestructural de dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural. 2.- El método según la reivindicación 1, en el cual el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie derivada de una bacteria corineforme. 3.- El método según la reivindicación 1, en el cual el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie derivada de Corynebacterium glutamicum. 4.- El método según la reivindicación 3, en el cual el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 29. 5.- El método según la reivindicación 1, en el cual el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie derivada de Corynebacterium ammoniagenes. 6.- El método según la reivindicación 5, en el cual el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2. 7.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual la parte pro-estructural corresponde a una parte pro-estructural de una transglutaminasa derivada de un actinomiceto. 8.- El método según la reivindicación 7, en el cual la parte pro-estructural tiene la secuencia según SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. 9.- El método según la reivindicación 7, en el cual una secuencia de aminoácidos de la parte pro-estructural, es cualquiera de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 38. 10.- El método según la reivindicación 1, en el cual la escisión y eliminación de la parte pro-estructural se efectúa con una proteasa. 11.- El método según la reivindicación 10, en el cual la bacteria corineforme que produce y secreta la transglutaminasa produce también la proteasa. 12.- El método según la reivindicación 11, en el cual la escisión y eliminación de la parte pro-estructural se realiza con la proteasa y una peptidasa. 13.- El método según la reivindicación 12, en el cual la bacteria corineforme que produce y secreta la transglutaminasa produce adicionalmente la proteasa y la peptidasa. lus.   14.- El método según la reivindicación 10 ó 12, en el cual la proteasa se deriva de un actinomiceto. 15.- El método según la reivindicación 10 ó 12, en el cual la proteasa se deriva de Streptomyces albogriseo- 16.- El método según la reivindicación 12, en el cual la peptidasa se deriva de un actinomiceto. 17.- El método según la reivindicación 12, en el cual la peptidasa se deriva de Streptomyces mobaraense. 18.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual la transglutaminasa es una transglutaminasa derivada de un actinomiceto. 19.- El método según la reivindicación 18, en el cual la transglutaminasa es la transglutaminasa derivada de Streptoverticillium mobaraense. 20.- El método según la reivindicación 19, en el cual la transglutaminasa tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 5. 21.- El método según la reivindicación 18, en el cual la transglutaminasa es una transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum.   22.- El método según la reivindicación 21, en el cual la transglutaminasa tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 43. 91

 

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