Procedimientos de producción de proteínas usando compuestos anti senescencia.

Un procedimiento de producción de una proteína en un cultivo celular que comprende las etapas de:

Cultivar células de mamífero transformadas con un gen que codifica una proteína de interés, el cual gen se expresa en condiciones de cultivo celular, en un medio de cultivo celular que comprende un compuesto anti senescencia seleccionado de entre carnosina, acetil-carnosina, homocarnosina, anserina, y β-alanina; en el que el compuesto anti senescencia se encuentra a una concentración de entre aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, y

mantener el cultivo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de la proteína;

en el que el cultivo celular muestra una característica de cultivo celular mejorada que difiere de una característica de cultivo celular correspondiente que podría observarse en condiciones por lo demás idénticas en un medio por lo demás idéntico que carece del compuesto anti senescencia;

en el que la característica de cultivo mejorada se selecciona del grupo que consiste en: título aumentado, productividad celular específica aumentada, acumulación de agregados de elevado peso molecular disminuida y acumulación de especies ácidicas disminuida, y combinaciones de los mismos.

Procedimientos de producción de proteínas usando compuestos anti senescencia Antecedentes de la invención

La presente divulgación se refiere, en general, a la producción de proteínas en cultivos de células de mamífero. En particular, la presente divulgación se refiere al cultivo de células de mamífero en presencia de un compuesto anti senescencia, por ejemplo carnoslna, para mantener la viabilidad y aumentar la productividad con mayor calidad. El cultivo de células ha producido muchos productos proteicos. Estos productos, tales como anticuerpos monoclonales producidos por hibridoma, pueden usarse para aplicaciones terapéuticas, de investigación u otras. Las células animales, de manera destacable células de mamífero, se usan a menudo para producir proteínas. Desafortunadamente, el uso de células animales hace que el proceso de producción consuma tiempo y sea costoso.

Añadir un agente químico a un medio de cultivo celular puede aumentar la productividad de células induciendo a las células a producir un producto, por tanto aumentando el rendimiento general. El agente óptimo a usar varía dependiendo de un número de factores, incluyendo el producto proteico deseado y el tipo celular. Factores similares también afectan a la cantidad del agente elegido añadido y a cuándo se añade el agente al medio de cultivo celular. Los ejemplos de agentes son ácidos o sales alcanóicas, derivados de la urea, o dlmetilsulfóxido (DMSO). Los agentes químicos, como el butirato sódico, pueden tener efectos diversos sobre la producción proteica. La adición de un agente puede aumentar la productividad específica de las células, pero también puede tener efectos citotóxicos y puede inhibir el crecimiento celular y la viabilidad.

A medida que las células producen una proteína, la proteína se secreta típicamente al medio de cultivo celular. La proteína específica, sin embargo, no es la única materia en el medio; también se encuentran a menudo en el medio agregados de elevado peso molecular, especies acídlcas, y otros materiales, que pueden hacer que el proceso de purificación sea más laborioso y costoso. Hay disponibles técnicas y procedimientos para mejorar la calidad de la producción, permitiendo una purificación de proteínas más eficiente; Incluyendo, entre otros, alterar las condiciones del biorreactor o usando una línea celular distinta. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad en el campo de las técnicas y procedimientos de producción de proteínas que conduzcan a procesos de purificación mejorados.

Por tanto, lo que se necesita es un agente químico que se añada al medio de cultivo celular que pueda potenciar la expresión de una proteína de interés a la vez que mantenga una elevada viabilidad celular. Lo que además se necesita es un agente que aumente la calidad del producto de la proteína disminuyendo la cantidad de agregados de elevado peso molecular y especies acídicas en el medio de cultivo celular.

Sumario de la invención

En determinadas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un proceso para la producción potenciada de un producto proteico. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de cultivo de células huésped que expresan una proteína de interés en un medio que comprende un compuesto anti senescencia de tal forma que la producción general de la proteína de interés se potencia. En determinadas realizaciones, dicho compuesto anti senescencia comprende carnosina.

En determinadas realizaciones, la presente Invención proporciona composiciones que potencian la producción de una proteína de interés. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un medio de cultivo celular que comprende un compuesto anti senescencia que potencia la producción de una proteína de interés expresada en una célula huésped. En determinadas realizaciones, dicho compuesto anti senescencia comprende carnosina. En determinadas realizaciones, se combinan células huésped manipuladas genéticamente con un medio inoculo para formar un medio de cultivo celular, que se crece en un biorreactor. Durante un ciclo de producción del producto proteico deseado, pueden alterarse las condiciones del biorreactor y/o pueden añadirse suplementos para aumentar la productividad y/o mantener la viabilidad. Los suplementos pueden incluir un medio de alimentación y/o uno o más aditivos como en la presente divulgación, carnosina y/o otros compuestos anti senescencia.

Las células huésped de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) pueden experimentar una reducción en la viabilidad al llegar al final de un ciclo de producción en un biorreactor. Se ha descubierto que la adición de un agente anti senescencia, como carnosina y análogos de la misma, a un medio de cultivo celular ayuda a mantener un número más elevado de células viables y la viabilidad celular hasta que se recoge la proteína.

Además, pueden usarse procedimientos para aumentar la productividad, como alterar la temperatura después de la etapa de crecimiento y/o durante la etapa de producción del ciclo de producción de acuerdo con la presente invención. Para dar solo un ejemplo, durante la producción de un producto proteico, en concreto el anticuerpo para el factor de diferenciación de crecimiento 8 (GDF-8), se disminuyó la temperatura para ayudar a iniciar y aumentar la productividad. En determinadas realizaciones, la adición de un compuesto anti senescencia como carnosina ayuda a aumentar la productividad del cultivo celular. En determinadas realizaciones, puede añadirse un compuesto anti senescencia antes, durante y/o después de dicho cambio de temperatura.

También se ha descubierto que la adición de un compuesto anti senescencia como carnosina a un medio de cultivo celular aumenta la calidad general del producto proteico. Durante la producción de la proteína, se encuentran en el medio de cultivo celular agregados de elevado peso molecular, junto con otras especies no deseadas. La adición de carnosina disminuye la cantidad de agregados de elevado peso molecular y aumenta la calidad del producto. En determinadas realizaciones, la adición de un compuesto anti senescencia distinto de carnosina disminuye la acumulación de dichos agregados de elevado peso molecular y mejora la calidad del producto. En determinadas realizaciones, la carnosina se añade en combinación con uno o más compuestos anti senescencia adicionales.

La concentración del compuesto anti senescencia (por ejemplo, carnosina) añadido al medio de cultivo celular puede variar dependiendo de varios factores del proceso, incluyendo, por ejemplo, el tipo celular, el producto deseado, y las condiciones del biorreactor, entre otros. También, puede sustituirse la carnosina por sus análogos: acetilcarnosina, homocarnosma, anserlna, y p-alanina. En determinada realizaciones, la carnosina se proporciona en combinación con uno o más compuestos anti senescencia adicionales. En determinadas realizaciones, la concentración del agente anti senescencia (por ejemplo, carnosina) en un medio de cultivo celular es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 1 mM. En determinadas realizaciones, la concentración es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM. En determinadas realizaciones, la concentración es de aproximadamente 2 mM.

Pueden usarse cualquier procedimiento de cultivo y medio inoculo adecuado para cultivarlas células en el proceso de producción de proteína. Pueden usarse tanto medio con suero como medio sin suero. Además, los procedimientos de cultivo pueden usarse para cultivar las células según sea necesario para el tipo celular y producto proteico específicos. Dichos procedimientos son conocidos y entendidos por los expertos en la técnica de cultivos celulares.

Otras características y ventajas de la divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1a. Efecto de la carnosina sobre los picos acídicos para MYO-29.

Figura 1b. Efecto de la carnosina sobre agregados de elevado peso molecular.

Figura 1c. Efecto sobre los picos acídicos de las adiciones de carnosina en días diferentes.

Figura 1d. Efecto de las adiciones de carnosina sobre los agregados de elevado peso molecular en días

diferentes.

Figura 2a. Efecto de la carnosina sobre la densidad de células viables diaria.

Figura 2b. Efecto de la carnosina sobre la viabilidad celular diaria.

Figura 2c. Efecto de la carnosina sobre el título diario.

Figura 2d. Efecto de la carnosina sobre la productividad celular específica acumulativa.

Figura 2e. Efecto de la carnosina sobre los agregados de elevado... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una proteína en un cultivo celular que comprende las etapas de:

Cultivar células de mamífero transformadas con un gen que codifica una proteína de interés, el cual gen se expresa en condiciones de cultivo celular, en un medio de cultivo celular que comprende un compuesto anti senescencia seleccionado de entre carnosina, acetil-carnosina, homocarnosina, anserina, y p-alanina; en el que el compuesto anti senescencia se encuentra a una concentración de entre aproximadamente 5 mM a aproximadamente 1 mM, y

mantener el cultivo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de la proteína; en el que el cultivo celular muestra una característica de cultivo celular mejorada que difiere de una característica de cultivo celular correspondiente que podría observarse en condiciones por lo demás idénticas en un medio por lo demás Idéntico que carece del compuesto anti senescencia;

en el que la característica de cultivo mejorada se selecciona del grupo que consiste en: título aumentado, productividad celular específica aumentada, acumulación de agregados de elevado peso molecular disminuida y acumulación de especies ácldlcas disminuida, y combinaciones de los mismos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto anti senescencia es carnosina.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha célula de mamífero es una célula CHO.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de interés es un anticuerpo.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un isótopo de IgG.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano recombinante.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es específicamente reactivo con el factor de diferenciación del crecimiento 8 (GDF-8) o un epítopo del mismo.

8. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo recombinante se une específicamente a BMP-11.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto anti senescencia se encuentra a una concentración de entre aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM.

1. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto anti senescencia está en una concentración de aproximadamente 2 mM.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto anti senescencia se añade en combinación con un medio de alimentación.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se mantiene dicha viabilidad celular en el momento de la recolección.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se aumenta la producción de dicha proteína de interés.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se aumenta la productividad específica de la célula de dicha proteína de interés.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la calidad de dicha proteína de interés se aumenta mediante una disminución de los agregados de elevado peso molecular.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la calidad de dicha proteína de interés se aumenta mediante una disminución en las especies ácidicas.