Procedimientos y métodos para modificar la expresión génica usando ARN no poliadenilado.

Un procedimiento para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés,

el cual normalmentepuede ser expresado en una célula eucariota, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de proporcionar al núcleo dedicha célula eucariota una molécula de ARN no poliadenilado que comprende más de una secuencia de nucleótidosespecifica diana, incluyendo dicha más de una secuencia de nucleótidos específica diana una secuencia de nucleótidoshomosentido específica diana esencialmente similar a parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir delácido nucleico de interés, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana incluye una secuenciade aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de 100% con la correspondienteparte del ácido nucleico diana, en el que dicho procedimiento no es un procedimiento de tratamiento del cuerpo humanoo animal mediante cirugía o terapia, ni un procedimiento diagnóstico ejecutado en el cuerpo humano o animal.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05016726.

Solicitante: COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION.

Nacionalidad solicitante: Australia.

Dirección: LIMESTONE AVENUE CAMPBELL, ACT 2612 AUSTRALIA.

Inventor/es: WANG,MING-BO, WATERHOUSE,PETER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01H1/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.Procedimientos de modificación de los genotipos (A01H 4/00 tiene prioridad).
  • C12N15/63 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.

PDF original: ES-2387393_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimientos y métodos para modificar la expresión génica usando ARN no poliadenilado

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés en células eucariotas proporcionando moléculas de ARN no poliadeniladas que comprenden más de una secuencia de nucleótidos específica diana homóloga con el ácido nucleico de interés, incluyendo una cadena homosentido, en el núcleo de las células eucariotas. Las moléculas de ARN no poliadeniladas específicas diana se pueden proporcionar mediante la introducción de ADN quiméricos, que cuando son transcritos bajo el control del promotor convencional y las regiones de formación y poliadeniladas del extremo 3', producen moléculas de ARN en las que al menos la señal de poliadenilación se puede eliminar por la actividad autocatalítica de un ribozima autoeliminador de intrones comprendido dentro de las moléculas de ARN transcritas. También se proporcionan células eucariotasy vegetales que comprenden dichas moléculas de ARN o ADN quimérico que codifica tales moléculas de ARN, así como las plantas o organismos no humanos eucariotas. Se proporcionan procedimientos y medios similares para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico mediante cosupresión en células eucariotas.

Antecedentes de la invención

El silenciamiento de genes postranscripcional (PTGS) o cosupresión, es un fenómeno común asociado con transgenes en las plantas transgénicas. El PTGS da como resultado la eliminación de una secuencia específica del ARN del transgén silenciado así como del ARN de genes endógenos homólogos o ARN vírico. Esto se caracteriza por niveles bajos de ARNm en estado de equilibrio manteniéndose tasas normales (normalmente altas) de transcripción nuclear de transgenes. Hay una serie de características comunes para el PTGS. El PTGS es:

i) específico de la secuencia; ii) sistemáticamente transmisible; iii) a menudo asociado con la presencia de múltiples copias de transgenes o con el uso de promotores fuertes; iv) frecuentemente correlacionado con la presencia de estructuras de ADN repetitivas, incluyendo patrones de

inserción de T-ADN repetido invertido;

v) a menudo acompañado de nueva metilación de ADN en la región de transcripción, y

vi) pueden ser restaurados por meiosis.

Se han propuesto una serie de modelos hipotéticos para explicar el PTGS (véase, por ejemplo Wassenegger and Pelissier, 1998) . Típicamente, estos modelos sugieren la implicación de una enzima codificada huésped (ARN polimerasa dirigida por ARN (RdRP) ) que se propone que usa ARN aberrantes como moldes para sintetizar moléculas de ARN copia pequeñas (ARNc) . Estos ARNc se hibridarían entonces con los ARNm diana para formar estructuras dúplex, haciendo de ese modo al ARNm susceptible de degradación por endorribonucleasas. Aun más, no hay ninguna prueba directa de que la RdRP esté involucrada en el PTGS en plantas.

Una cuestión importante que surge de los modelos existentes es qué 20 tipo de ARN es el ARN aberrante que sería usado como una molde por la RdRP y en el qué compartimiento celular funcionaría la RdRP.

Varias publicaciones han descrito la acumulación de ARN transgénico improductivo o no poliadenilado en vegetales que es silenciado después de la transcripción. (Lee y Col., 1997; van Eldik y Col. 1998; Covey y Col., 1997; van Houdt y Col., 1997; Metzlaff y Col., 1997) .

Los siguientes documentos describen los procedimientos y medios para regular o inhibir la expresión génica en una célula.

Los documentos US 5.190.131 y EP 0467349 A1 describen procedimientos y medios para regular o inhibir la expresión génica en una célula por la incorporación o asociación con el material genético de la célula, de una secuencia de ácido nucleico no nativa, que es transcrita para producir un ARNm que es complementario y capaz de unirse al ARNm producido por el material genético de esa célula.

El documento EP 0223399 A1 describe procedimientos para llevar a cabo cambios somáticos útiles en plantas causando la transcripción en las células de la planta de cadenas negativas de ARN, que son sustancialmente complementarias de una cadena de ARN diana. La cadena de ARN diana puede ser un transcrito de ARNm creado en la expresión génica, un ARN vírico u otro ARN presente en las células de la planta. La cadena negativa de ARN es complementaria de al menos una porción de la cadena de ARN diana para inhibir su actividad in vivo.

El documento EP 0240208 describe procedimientos para regular la expresión de genes codificados en genomas de células vegetales, logrado por la integración de un gen bajo el control transcripcional de un promotor que es funcional en el huésped, y en el que la cadena de ADN transcrita es complementaria de la cadena de ADN que es transcrita a partir del gen o genes endógenos que se desean regular.

El Documento EP 0647715 A1 y las patentes americanas 5.034.323, 5.231.020 y la 5.283.184 describen procedimientos y medios para producir plantas que manifiesten rasgos fenotípicos deseados, mediante la selección de transgenotes que comprenden un segmento de ADN operativo unido a un promotor, donde los productos de la transcripción del segmento son sustancialmente homólogos a los transcritos correspondientes de genes endógenos, particularmente genes endógenos de la ruta biosintética de los flavonoides.

Waterhouse y col. 1998 describen que la resistencia vírica y el silenciamiento de genes en plantas se pueden inducir mediante la expresión simultánea del ARN homosentido y antisentido. El ARN homosentido y antisentido pueden estar situados en un transcrito que tiene autocomplementaridad.

Hamilton y col.1998 describen que un transgén con ADN repetido, es decir, copias invertidas de su región 5' no traducida, produce con mucha frecuencia la supresión postranscripcional de la expresión de la ACC-oxidasa en el tomate.

El documento WO 98/53083 describe construcciones y procedimientos para aumentar la inhibición de un gen diana dentro de un organismo que implica insertar en el vector silenciador del gen una secuencia repetida invertida de todo o parte de una región polinucleótica dentro del vector.

El documento WO 95/34688 describe procedimientos para la inhibición citoplasmática de la expresión génica y proporciona construcciones genéticas para la expresión de ARN inhibidor en el citoplasma de células eucariotas. El ARN inhibidor puede ser un ARN antisentido o un cosupresor. Las construcciones genéticas son aptas para la replicación en el citoplasma de una célula eucariótica y comprenden una región promotora, la cual puede ser un promotor subgenómico de virus vegetal en combinación funcional con la región codificadora de ARN.

Los documentos WO95/15394 y US 5908779 describen un procedimiento y la construcción para la regulación de la expresión génica a través de la inhibición de ARN nuclear antisentido en células (de ratón) . La construcción comprende un promotor, secuencias antisentido y un ribozima cis o trans que genera extremos 3' independientemente de la maquinaria de poliadenilación, y así inhibe el transporte de la molécula de ARN al citoplasma.

Resumen de la invención.

La invención proporciona un procedimiento para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés, el cual normalmente puede ser expresado en una célula eucariota, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de proporcionar al núcleo de dicha célula eucariota una molécula de ARN no poliadenilado que comprende más de una secuencia de nucleótidos específica diana, incluyendo dicha más de una secuencia de nucleótidos específica diana una secuencia de nucleótidos homosentido específica diana esencialmente similar a parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir del ácido nucleico de interés, incluyendo dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana una secuencia de aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de 100% con la correspondiente parte del ácido nucleico diana, en el que dicho procedimiento no es un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, ni un procedimiento diagnóstico ejecutado en el cuerpo humano o animal.

En una realización, la más de una secuencia de nucleótidos específica... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés, el cual normalmente puede ser expresado en una célula eucariota, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de proporcionar al núcleo de dicha célula eucariota una molécula de ARN no poliadenilado que comprende más de una secuencia de nucleótidos especifica diana, incluyendo dicha más de una secuencia de nucleótidos específica diana una secuencia de nucleótidos homosentido específica diana esencialmente similar a parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir del ácido nucleico de interés, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana incluye una secuencia de aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de 100% con la correspondiente parte del ácido nucleico diana, en el que dicho procedimiento no es un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano

o animal mediante cirugía o terapia, ni un procedimiento diagnóstico ejecutado en el cuerpo humano o animal.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha más de una secuencia de nucleótidos específica diana también incluye una secuencia de nucleótidos antisentido específica diana esencialmente similar al complemento de parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir de dicho ácido nucleico de interés, y dichas secuencias de nucleótidos homosentido y antisentido específicas diana son esencialmente complementarias entre sí y son capaces de formar una estructura de horquilla entre sí.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos antisentido específica diana incluye una secuencia de aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de 100% con la correspondiente parte del ácido nucleico diana.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente al menos 95% con dicha parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente 100% con, bastante especialmente es idéntica a, dicha parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

6. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos antisentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente al menos 95% con dicho complemento de parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha secuencia de nucleótidos antisentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente 100% con, bastante especialmente es idéntica a, dicho complemento de parte de una molécula de ARN transcrita o producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

8. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha célula eucariota es una célula animal.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha célula animal es una célula humana.

10. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha célula eucariota es una célula cultivada.

11. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana corresponde a uno o más exones consecutivos de dicho ácido nucleico de interés.

12. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana corresponde a una región transcrita y traducida de dicho ácido nucleico de interés.

13. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana corresponde a una región no traducida del ARN producido a partir del ácido nucleico de interés.

14. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN no poliadenilado es producido por transcripción de un gen quimérico comprendido dentro de dicha célula eucariota, comprendiendo dicho gen quimérico un promotor funcional en dicha célula eucariota vinculado operativamente a una región de ADN específica diana que codifica dicho ARN.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el promotor es un promotor constitutivo.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el promotor es un promotor inducible.

17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el promotor es un promotor específico de tejido,

18. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el promotor es reconocido por una ARN polimerasa de una sola subunidad a partir de un bacteriófago.

19. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el promotor es reconocido por una ARN polimerasa I ó III eucariota y dicho gen quimérico comprende adicionalmente un terminador para dicha polimerasa I ó III.

20. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico de interés es un gen incorporado en el genoma de dicha célula eucariota.

21. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico de interés es un gen endógeno de dicha célula eucariota.

22. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico de interés es un transgén que ha sido introducido en dicha célula eucariota.

23. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico de interés es un ácido nucleico viral.

24. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN no poliadenilado carece de una estructura de caperuza en 5’.

25. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN no poliadenilado comprende un intrón persistente.

26. Un gen quimérico que codifica una molécula de ARN no poliadenilado, comprendiendo dicha molécula de ARN no poliadenilado más de una secuencia de nucleótidos específica diana, incluyendo dicha más de una secuencia de nucleótidos específica diana una secuencia de nucleótidos homosentido específica diana esencialmente similar a parte de una molécula de ARN producida a partir de un ácido nucleico de interés, siendo dicha secuencia homosentido de nucleótidos específica diana esencialmente similar a parte de una molécula de ARN producida a partir de un ácido nucleico de interés e incluyendo una secuencia de aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de 100% con la secuencia de una correspondiente parte de dicho ácido nucleico de interés, en el que dicho ácido nucleico de interés está presente normalmente en una célula eucariota y en el que dicho ARN no poliadenilado reduce la expresión de dicho ácido nucleico de interés cuando se proporciona al núcleo de dicha célula ARN, comprendiendo dicho gen quimérico un promotor funcional en dicha célula eucariota vinculado operativamente a una región de ADN específica diana que codifica ARN,

27. El gen quimérico de la reivindicación 26, en el que dicha más de una secuencia de nucleótidos específica diana también incluye una secuencia de nucleótidos antisentido específica diana esencialmente similar al complemento de parte de una molécula de ARN producida a partir de dicho ácido nucleico de interés, y dichas secuencias de nucleótidos homosentido y antisentido específicas diana son esencialmente similares entre sí y capaces de formar una estructura de horquilla entre sí.

28. El gen quimérico de la reivindicación 27, en el que dicha secuencia de nucleótidos específica diana incluye una secuencia de aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de 100% con la correspondiente parte del ácido nucleico diana.

29. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que dicha secuencia de nucleótidos específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente al menos 95% con dicha parte de una molécula de ARN producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

30. El gen quimérico de la reivindicación 29, en el que dicha secuencia de nucleótidos homosentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente 100% con, bastante especialmente es idéntica a, dicha parte de una molécula de ARN producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

31. El gen quimérico de la reivindicación 27, en el que dicha secuencia de nucleótidos antisentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente al menos 95% con dicho complemento de parte de una molécula de ARN producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

32. El gen quimérico de la reivindicación 31, en el que dicha secuencia de nucleótidos antisentido específica diana tiene una identidad de secuencia de aproximadamente 100% con, bastante especialmente es idéntica a, dicho complemento de parte de una molécula de ARN producida a partir de dicho ácido nucleico de interés.

33. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que la célula eucariota es una célula animal.

34. El gen quimérico de la reivindicación 33, en el que la célula animal es una célula humana.

35. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que el ácido nucleico de interés es un gen incorporado en el genoma de dicha célula eucariota.

36. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que el ácido nucleico de interés es un gen endógeno de dicha célula eucariota.

37. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que el ácido nucleico de interés es un transgén que ha sido introducido en dicha célula eucariota.

38. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que el ácido nucleico de interés es un ácido nucleico viral.

39. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que dicho ARN no poliadenilado carece de una estructura de caperuza en 5’.

40. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que dicho ARN no poliadenilado comprende un intrón persistente.

41. El gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, en el que el promotor es reconocido por una ARN polimerasa I ó III eucariota y en el que dicho gen quimérico comprende adicionalmente un terminador para dicha polimerasa I ó III.

42. Una célula eucariota cultivada que comprende el gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27 o que comprende en su núcleo una molécula de ARN no poliadenilado susceptible de ser producida por el gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27.

43. La célula eucariota de la reivindicación 42, que es una célula animal.

44. La célula animal de la reivindicación 43, que es una célula humana.

45. La célula de la reivindicación 42, que tiene un fenotipo modificado en comparación con una correspondiente célula eucariota que carece de dicho ARN no poliadenilado o gen quimérico.

46. Un organismo eucariota no humano, que comprende la célula de la reivindicación 42.

47. El organismo eucariota no humano de la reivindicación 46, que es un animal.

48. Una célula eucariota obtenida por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

49. Uso in vitro del gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27 proporcionado al núcleo de dicha célula eucariota para identificar el fenotipo asociado con la expresión de dicho ácido nucleico de interés en dicha célula eucariota.

50. El uso de la reivindicación 49, en el que el fenotipo se observa después del cultivo de las células eucariotas.

51. El uso de la reivindicación 49, en el que el fenotipo es un perfil modificado de metabolitos sintetizados en dicha célula.

52. Uso del gen quimérico de la reivindicación 26 ó 27, para producir un ARN no poliadenilado por transcripción del gen quimérico en una célula eucariota.

Figura 1


 

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