Un procedimiento para aislar y almacenar ácidos nucleicos, que comprende:

a. proporcionar un medio en fase sólida;

b. aplicar una muestra que comprenda células que contienen ácidos nucleicos al medio en fase sólida;

c. retener las células con el medio en fase sólida como un retenido celular y eliminar los contaminantes;

d. poner en contacto el retenido celular con una disolución que comprende un tensioactivo o detergente;

e. lisar el retenido celular para formar un lisado celular mientras se retiene el lisado celular en el medio en fase sólida, comprendiendo el lisado celular los ácidos nucleicos;

f. secar el medio en fase sólida con el lisado celular que comprende los ácidos nucleicos; y

g. almacenar el medio en fase sólida secado con los ácidos nucleicos.

Procedimientos y materiales para utilizar compuestos químicos como herramienta para el almacenamiento de ácidos nucleicos sobre medios de sistemas de purificación de ácidos nucleicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para almacenar ácidos nucleicos procedentes de una muestra que contenga ácidos nucleicos, tal como una muestra de células o un lisado celular. Los ácidos nucleicos se aislan y pueden almacenarse de forma eficaz durante periodos extensos de tiempo a temperatura y humedad ambientes sobre una amplia variedad de filtros y otros tipos de medios en fase sólida. La invención proporciona procedimientos para almacenar muestras que contengan ácidos nucleicos sobre una amplia gama de medios en fase sólida en muchos tipos de tubos, columnas o placas de múltiples pocillos, muchos de los cuales están disponibles en el mercado.

Antecedentes de la invención

La genotipificación es la disciplina de identificar el genoma de un individuo con relación a alelos y/o mutaciones específicos de enfermedades que se producen como efecto de los lazos familiares. La purificación rápida del ADN genómico humano es una parte esencial de un proceso de genotipificación; el ADN genómico de un individuo es la unidad estructura para la secuencia de ADN completa de todos los alelos expresados.

La secuenciación del ADN humano es una operación compleja. Para realizar el análisis de la secuencia en regiones de los cromosomas que puedan contener porciones de mutaciones o secuencias específicas de enfermedades se amplifican porciones seleccionadas, por ejemplo, mediante PCR, y los productos amplificados se secuencian. Las porciones seleccionadas de los cromosomas que se amplifican son impuestas por la secuencia específica de los cebadores utilizados en la amplificación mediante PCR, como los utilizados en estudios de unión para determinar si una secuencia que porta una enfermedad se encuentra en un cromosoma concreto. Los conjuntos de cebadores que se utilizan en los estudios de genotipificación están disponibles en el mercado y son representativos del cromosoma que se está estudiando. Debido a la extensa longitud de los cromosomas se realizan muchas reacciones de PCR sobre el molde de ADN genómico procedente de un único paciente.

Aunque se han desarrollado procedimientos relativamente rápidos y convenientes para la purificación de diversos tipos de ácidos nucleicos (tales como ADN genómico, ADN complementario (ADN), ADN mitocondrial o cloroplástico, o diversos tipos de ARN) en agarosa, la extracción de los ácidos nucleicos directamente de muestras de partida más complejas, como células y lisados celulares, sigue siendo una operación relativamente difícil. En conjunto, la mayoría de los procedimientos que se practican en la actualidad para purificar ácidos nucleicos de muestras que contienen ácidos nucleicos que comprenden células o lisados celulares sigue requiriendo mucho tiempo y trabajo. Además, la conservación de los ácidos nucleicos aislados normalmente implica mantener un vial de los ácidos nucleicos en disolución en una nevera o, preferiblemente, en un congelador. La conservación a largo plazo de numerosas muestras requiere una gran cantidad de espacio en el congelador. Estos requerimientos de conservación dan como resultado un alto consumo de energía y muchos gastos, y hacen que el aislamiento de ácidos nucleicos sobre el terreno sea difícil o incluso, en algunas circunstancias, imposible.

Se han intentado minimizar las etapas laboriosas y largas de los procedimientos previamente utilizados para aislar ácidos nucleicos a partir de estas muestras más complejas. Uno de estos procedimientos se describe en el documento EP 0389063. El procedimiento descrito en el documento EP 0389063 implica mezclar la muestra de células (tal como sangre completa) con una sustancia caotrópica y una fase sólida en partículas de unión a ácidos nucleicos que comprende sílice o un derivado de éste. Se sabe que, en presencia de una sustancia caotrópica, los ácidos nucleicos se liberan de las células y se unen a fases sólidas de unión a ácidos nucleicos con una base de sílice. Posteriormente, la mezcla se centrífuga para sedimentar la fase sólida con los ácidos nucleicos unidos a ella, y el sobrenadante se rechaza. El material sedimentado se somete a varias etapas de lavado con el agente caotrópico y con disolventes orgánicos. Por último, el ADN se eluye de la fase sólida en un tampón de bajo contenido en sales.

El procedimiento descrito en el documento EP 0389063 no resulta ventajoso porque es un procedimiento en múltiples etapas con mucho trabajo manual. En vista del hecho de que el procedimiento implica una serie de etapas de centrifugación y de transferencia de recipientes, este procedimiento no resulta adecuado para su automatización. Además, el ADN eluido aún requiere su conservación en disolución a baja temperatura.

Las patentes de EEUU nº 5.187.083 y 5.234.824 describen cada una un procedimiento para obtener con rapidez ADN sustancialmente puro a partir de una muestra biológica que contenga células. Los procedimientos implican lisar suavemente las membranas de las células para producir un lisado que contenga ADN genómico en una forma de alto peso molecular. El lisado se hace pasar a través de un filtro poroso para atrapar, de forma selectiva, el ADN de alto peso molecular sobre el filtro. El ADN se libera del filtro utilizando una disolución acuosa.

Se ha intentado facilitar la purificación de ADN genómico humano utilizando una diversidad de procedimientos (Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989)). Por consiguiente, muchos fabricantes de kits comerciales proporcionan productos para estas técnicas: AmpReady^TM (Promega, Madison, Wisconsin), DNeasy^TM (Qiagen, Valencia, California) y Split Second^TM (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, Indiana). Estos productos se basan en el uso de matrices especializadas o sistemas de tampones para el aislamiento rápido de la molécula de ADN genómico.

En fechas más recientes se han intentado utilizar técnicas basadas en filtros microporosos como herramientas para la purificación de ADN genómico, así como de una gran multitud de ácidos nucleicos. La ventaja de las matrices basadas en filtros es que pueden diseñarse en muchos formatos que incluyen tubos, tubos de centrifugación, láminas y placas de múltiples pocillos. Las membranas de filtros microporosos como matrices de soporte para la purificación tienen otras ventajas en la técnica. Proporcionan un sistema compacto y fácil de manipular que permite la captura de las moléculas deseadas y la eliminación de componentes no deseados en una fase fluida con un mayor rendimiento y unos tiempos de procesamiento más rápidos que los que se consiguen con una cromatografía en columna. Esto es debido a las rápidas velocidades de difusión que son posibles sobre las membranas de filtros.

Las moléculas de ácidos nucleicos se han capturado sobre membranas de filtros, en general mediante la simple adsorción o mediante una reacción química entre grupos reactivos complementarios presentes sobre la membrana de filtro o sobre un ligando unido al filtro dando como resultado la formación de un enlace covalente entre el ligando y el ácido nucleico deseado.

Los materiales de membranas de filtros porosos utilizados para la inmovilización de ácidos nucleicos no covalente incluyen materiales como el nailon, la nitrocelulosa, el poli(fluoruro de vinilidino) (PVDF) hidrófobo y las microfibras de vidrio. También se ha desarrollado una serie de procedimientos y de reactivos para permitir el acoplamiento directo de los ácidos nucleicos sobre soportes sólidos, tales como oligonucleótidos y cebadores. También se ha indicado el entrecruzamiento del ADN con UV (Church et al., PNAS, vol. 81, p. 1991, 1984), el kit de captura en columna Generation (Gentra Systems, Minneapolis, MN) y la unión de ARN a membranas de nailon.

Se han utilizado muchos procedimientos químicos para la inmovilización de moléculas, tales como ácidos nucleicos, sobre membranas de filtros. Por ejemplo, papel activado (TransBind^TM, Schleicher & Schuell Ltd., Keene, N.H.), membranas de PVDF revestidas con hidrogel activado con carbodiimidazol (Immobilin-IAV^TM, Millipore Corp., Bedford, Mass.), papel de MAP (Amersham, Littlechalfont Bucks, Wisconsin), nailon activado (BioDyne^TM, Pall Corp., Glen Cove, N.Y.), y nitrocelulosa activada con DVS y bromuro de cianógeno.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aislar y almacenar ácidos nucleicos, que comprende:

a. proporcionar un medio en fase sólida;

b. aplicar una muestra que comprenda células que contienen ácidos nucleicos al medio en fase sólida;

c. retener las células con el medio en fase sólida como un retenido celular y eliminar los contaminantes;

d. poner en contacto el retenido celular con una disolución que comprende un tensioactivo o detergente;

e. lisar el retenido celular para formar un lisado celular mientras se retiene el lisado celular en el medio en fase sólida, comprendiendo el lisado celular los ácidos nucleicos;

f. secar el medio en fase sólida con el lisado celular que comprende los ácidos nucleicos; y

g. almacenar el medio en fase sólida secado con los ácidos nucleicos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que, antes de la etapa de secado f, el medio en fase sólida con los ácidos nucleicos se lava para eliminar los contaminantes mientras que los ácidos nucleicos son retenidos en el medio en fase sólida.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio en fase sólida con los ácidos nucleicos en la etapa g se mantiene sustancialmente a una temperatura de 5ºC a 40ºC.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:

h. eluir los ácidos nucleicos del medio sólido.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que, antes de la etapa de elución h, el medio en fase sólida secado con los ácidos nucleicos se lava para eliminar los contaminantes mientras que los ácidos nucleicos son retenidos en el medio en fase sólida.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el almacenamiento de los ácidos nucleicos en la etapa g tiene una duración de al menos una semana.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el almacenamiento de los ácidos nucleicos en la etapa g tiene una duración de al menos un mes.

8. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el almacenamiento de los ácidos nucleicos en la etapa g tiene una duración de al menos tres meses.

9. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el almacenamiento de los ácidos nucleicos en la etapa g tiene una duración de al menos cinco meses.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio en fase sólida comprende un filtro que comprende una pluralidad de fibras.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el filtro tiene una estructura sustancialmente desordenada.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que los diámetros de las fibras están en el intervalo de 1 μm a 10 μm.

13. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el filtro comprende uno o más poros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 μm a aproximadamente 2,7 μm.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio en fase sólida comprende:

a. un medio en fase sólida de vidrio o con una base de sílice;

b. un medio en fase sólida con una base de plástico; o

c. un medio en fase sólida con una base de celulosa.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio en fase sólida se selecciona de uno de los siguientes: vidrio, fibra de vidrio, microfibras de vidrio, sílice, gel de sílice, óxido de sílice, celulosa, nitrocelulosa, carboximetilcelulosa, poliéster, poliamida, polímeros de carbohidratos, polipropileno, politetrafluoroetileno, poli(fluoruro de vinilidino), lana o cerámica porosa.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tensioactivo o detergente de la etapa d comprende un tensioactivo o detergente aniónico.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el tensioactivo o detergente aniónico comprende dodecilsulfato de sodio.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la concentración de dodecilsulfato de sodio está entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso/volumen.

19. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la disolución de la etapa d comprende además:

ii. una base débil; y

iii. un agente quelante.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la disolución de la etapa d comprende además:

iv. ácido úrico o una sal urato.

21. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el retenido celular comprende material condensado procedente del núcleo.

22. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el retenido celular comprende células enteras intactas, y en el que la etapa e comprende:

i. romper las células enteras intactas retenidas por el medio en fase sólida para dejar el material condensado procedente del núcleo retenido por el medio; y

ii. lisar el material condensado procedente del núcleo para formar el lisado celular que contienen los ácidos nucleicos.

23. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición y las dimensiones del medio en fase sólida se seleccionan de forma que los ácidos nucleicos son retenidos por el medio en la etapa e sustancialmente mediante interacciones no iónicas.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que las interacciones no iónicas comprenden interacciones dipolo-dipolo, interacciones dipolo-dipolo inducido, fuerzas de dispersión o enlaces de hidrógeno.

25. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de retención e se define también como el retraso físico del movimiento de los ácidos nucleicos a través del medio en fase sólida.

26. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio en fase sólida es capaz de retener las células y los ácidos nucleicos en ausencia de un caotropo.

27. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa b comprende además concentrar las células en el medio en fase sólida.

28. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que los ácidos nucleicos se calientan hasta una temperatura elevada de 65ºC a 125ºC antes de la etapa de elución h.

29. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que los ácidos nucleicos se calientan hasta una temperatura elevada de 80ºC a 95ºC antes de la etapa de elución h.

30. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en leucocitos, células epiteliales, células bucales, células en cultivos de tejidos, semen, células vaginales, células del tracto urinario, células vegetales, células bacterianas y células colorrectales.

31. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células son leucocitos, y el procedimiento comprende además aplicar sangre completa al medio en fase sólida y obtener el lisado celular de los leucocitos.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, que comprende además lisar los eritrocitos de la sangre completa.

33. El procedimiento de la reivindicación 31 ó la reivindicación 32, que comprende además lavar el medio en fase sólida para eliminar los contaminantes.

34. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende células sanguíneas, y las dimensiones del medio en fase sólida se seleccionan de manera que la mayoría de las células retenidas en la etapa c comprenden leucocitos.

35. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos comprenden ADN o ARN.

36. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos comprenden ADN genómico.

37. Un procedimiento para aislar y almacenar ácidos nucleicos, que comprende:

a. proporcionar un medio en fase sólida;

b. aplicar una muestra que comprenda células que contienen ácidos nucleicos al medio en fase sólida y concentrar las células en el medio en fase sólida;

c. retener las células concentradas con el medio en fase sólida como un retenido celular concentrado y eliminar los contaminantes;

d. poner en contacto el retenido celular concentrado con una disolución que comprende:

e. lisar el retenido celular concentrado para formar un lisado celular mientras se retiene el lisado celular en el medio en fase sólida, comprendiendo el lisado celular los ácidos nucleicos;

f. secar el medio en fase sólida con el lisado celular que comprende los ácidos nucleicos;

g. almacenar el medio en fase sólida secado con los ácidos nucleicos durante al menos una semana; y

h. eluir los ácidos nucleicos del medio en fase sólida.

38. Un procedimiento para aislar y almacenar ADN, que comprende:

a. proporcionar un medio en fase sólida, en el que el medio en fase sólida comprende un filtro que comprende una pluralidad de fibras, en el que las fibras comprenden:

b. aplicar una muestra que comprenda células que contienen ADN al medio en fase sólida y concentrar las células en el medio en fase sólida;

c. retener las células concentradas con el medio en fase sólida como un retenido celular concentrado y eliminar los contaminantes;

d. poner en contacto el retenido celular concentrado con una disolución que comprende:

e. lisar el retenido celular concentrado para formar un lisado celular mientras se retiene el lisado celular en el medio en fase sólida, conteniendo el lisado celular el ADN;

f. secar el medio en fase sólida con el lisado celular que comprende el ADN;

g. almacenar el medio en fase sólida secado con el ADN a una temperatura de 5ºC a 40ºC durante al menos una semana;

h. calentar el ADN con el medio en fase sólida hasta una temperatura elevada de 65ºC a 125ºC; y

i. eluir el ADN del medio en fase sólida.