Procedimientos de purificación de ADN.

Procedimiento para purificar ADN plásmido a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza de la célula huésped que comprende las siguientes etapas:

(a) formar una solución mediante la adición de suficiente sal a dicha mezcla en donde dicha solución tiene una concentración de sal en el rango de aproximadamente 2M a 4M para permitir la unión selectiva de dicha al menos una impureza de célula huésped a un medio de interacción hidrofóbica;

(b) contactar dicha solución que contiene ADN plásmido con dicho medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones en que dicha al menos una impureza se une al medio de interacción hidrofóbica para formar un complejo; y

(c) recoger ADN plásmido no unido a partir de dicho complejo; en donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.

Procedimientos de purificación de ADN.

La presente invención proporciona procedimientos para la purificación de ADN plásmido que incluye la extracción de impurezas de la célula huésped, tales como endotoxinas, ARN, proteínas y ADN de la célula huésped, a partir de una solución acuosa que contiene ADN plásmido y procedimientos para la separación y purificación de ADN plasmídico superenrollado de una solución acuosa que contiene una mezcla de ADN plásmido superenrollado y nicked o relajado utilizando medio de interacción hidrofóbica. También se proporcionan procedimientos mejorados para pequeña escala, tales como laboratorio o escala de unidad de banco, purificación de ADN y equipamiento utilizado en tales procedimientos. La presente invención proporciona ADN purificado y/o separado, tal como plásmido, preferentemente superenrollado, ADN.

La terapia génica ofrece un paradigma de nuevo tratamiento para curar enfermedades humanas. El uso de ADN para el tratamiento de enfermedades genéticamente causadas, incluyendo fibrosis quística, varios tipos de cáncer, etc., e inmunización contra enfermedades, es un prometedor modo de terapia que en la actualidad es ampliamente perseguido. Más que alterar el fenotipo de la enfermedad mediante el uso de agentes que interactúan con productos génicos, o son en sí mismos productos génicos, la terapia génica puede teóricamente modificar genes específicos resultando en la cura o tratamiento de la enfermedad. La terapia génica también puede utilizarse como un sistema de suministro de fármacos. Para lograr esto, un gen que produce un producto útil (ARN, péptido, proteína, etc.) o es en sí mismo un producto útil (tales como en el uso de ADN antisentido) sería insertado en el ADN o célula de una célula homóloga, heteróloga o autóloga de un individuo o célula huésped para ser administrada luego a un individuo, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Por ejemplo, durante la cirugía de vasos sanguíneos, un gen que produce un factor anti coagulación sería insertado en el ADN de células que revisten los vasos sanguíneos para ayudar a prevenir la formación de coágulos de sangre peligrosos. Muchas otras condiciones también pueden conducir al tratamiento utilizando esta aproximación general.

La terapia génica espera que sea una herramienta poderosa para tratar muchos de los más de 4.000 desórdenes genéticos conocidos, incluyendo fibrosis quística, enfermedad coronaria, cáncer, artritis, y otras enfermedades. La terapia génica generalmente requiere la transferencia de material genético (ADN) en un individuo. La entrega genética o la entrega de material genético can puede lograrse tanto mediante administración directa del 100 que contiene el virus o ADN plásmido a la sangre tejidos, indirectamente a través de la introducción de células manipuladas en el laboratorio para abrigar ADN extraño o a través de diferentes técnicas de encapsulado o de portador conocidas en la técnica. Informes recientes sugieren que la entrega directa de ADN también puede ser posible. Varios sistemas distintos están en uso o bajo consideración para la transferencia somática de genes. Estas incluyen, por ejemplo, ADN (tanto desnudo o acomplejado), virus ARN (retrovirus), y virus ADN (adenovirus, virus adenoasociado [AAV], virus del herpes, y virus de la viruela).

Las ventajas claves del modo de terapia génica no viral, tales como el uso de ADN plásmido, es la facilidad de preparación en grandes cantidades, un alto grado de seguridad, una falta general de integración del ADN heterólogo en el ADN del astro la huésped, y la posibilidad de utilizar gen(es) o fragmentos de gen (es) virtualmente de tamaño y número ilimitado. Además, el uso de ADN plásmido en la terapia génica generalmente no implican el uso de gen(es) o proteínas extraños que pueden inducir una respuesta inmune no deseada en el receptor. Además, las alternativas al uso del ADN plásmido, tales como vectores virales, son relativamente más caras de producir.

Los procedimientos actualmente utilizados para producir ADN plásmido generalmente proporcionan una mezcla de ADN plásmido superenrollado y un artefacto ADN nicked (o relajado), que generalmente no es útil en la aplicación final del ADN plásmido. Los procedimientos de la presente invención proporcionan una separación no destructiva de ADN plásmido superenrollado y nicked de forma tal que mientas los presentes procedimientos se ejemplifican mediante la recuperación y uso del ADN plásmido superenrollado, una persona de habilidad ordinaria apreciará que cualquier forma separada del ADN plásmido puede ser considerada un producto útil de los procedimientos aquí divulgados. Además, mientras la presente divulgación enfatiza la necesidad de una mayor pureza del ADN plásmido superenrollado en el contexto de la terapia génica, una persona de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que el ADN plásmido es ampliamente utilizado en biología recombinante molecular más allá del uso en preparaciones de terapia génica y la invención aquí divulgada encuentra una amplia aplicabilidad como un procedimiento preparatorio para ADN plásmido superenrollado aislado y purificado.

Los procedimientos actualmente disponibles para la separación de las dos formas de ADN plásmido utilizan cromatografía de intercambio de iones (A novel, rapid process for purification of plasmids for gene therapy (Bhikhabhai R. Ollivier M. and Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R & D, 75184 Uppsala, Sweeden and RPR Gencell, Rhone-Poulenc Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, France. Publication number: 18-1129-51; Preparative purification of supercoiled plasmid DNA utilizando anion exchange chromatography, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) o cromatografía de exclusión (Prazeres, D.M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for Plasmid Purification, Biotechnology Techniques Vol. 11, No. 6, June 1997, p 417-420), acopladas con el uso de aditivos tales como polietilen glicol (PEG), detergentes, y otros componentes tales como cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona (PVP). Recientemente se concedió una patente (Horn, et al (Patente U.S. No. 5.707.812)) para la purificación de ADN plásmido superenrollado usando PEG como un aditivo. Sin embargo, procedimientos actualmente conocidos son incapaces de proporcionar una separación eficiente y de coste efectivo de ADN superenrollado y nicked (o relajado). Además, muchos de los procedimientos conocidos sufren de la desventaja de utilizar PEG u otros aditivos, que pueden no ser deseados en la fabricación de ADN plásmido, al requerir procedimientos de separación, eliminación y control de calidad adicionales, que pueden ser difíciles, consumir más tiempo y más caros.

Formas alternativas de procedimientos conocidos para la separación de formas superenrolladas y relajadas de ADN plásmido utilizan resinas muy caras, propietarias, que también utilizan solventes, tales como acetonitrilo, etanol y otros componentes, como trietilamina y tetrabutil fosfato de amonio, durante el proceso. Estos procedimientos generalmente no son adecuados para producción en gran escala debido al uso de solventes. Además, no pueden aplicarse a materiales iniciales que tienen cantidad significativas de ADN plásmido relajado ya que la cantidad abundante de ADN plásmido relajado contaminante en los materiales iniciales tiende a reducir las capacidades de resolución de estas resinas. (Green, A. P. et al. Bio. Pharm. Vol. 10, No. 5, páginas 52-62, Mayo 1997).

Procedimientos adicionales de separación de ADN superenrollado y relajado se basan en la cromatografía de exclusión, que implica la separación de las dos formas de ADN plásmido basada en la pequeña diferencia de tamaño. Estas columnas tienden a ser relativamente largas, presentando significativos problemas de escala, haciendo no factible implementar en la producción en gran escala. Además los procedimientos de exclusión necesitan muestras concentradas de soluciones, que no es factible obtener con soluciones de ADN plásmido, debido a la naturaleza altamente viscosa del ADN. Ver, A comparison of gel filtration chromatographic supports for plasmid purification G.N.M. Ferreira, J.M.S. Cabral and D.M.F. Prazeres, Biotechnology Techniques, Volume 11, No. 6, June 1997, pp 417-420.

Las preparaciones de ADN plásmido, que son producidas a partir de preparaciones bacterianas y con frecuencia contienen una mezcla... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para purificar ADN plásmido a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza de la célula huésped que comprende las siguientes etapas:

en donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde la al menos una impureza es seleccionada del grupo consistente en ARN, endotoxina, ADN cromosómico y proteína.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde la al menos una impureza es una endotoxina.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO₄^2-, Cl^-, Br^-, NO₃^-, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺ y NH₄⁺.

5. Procedimiento según la reivindicación 4 en donde la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de 2M a 4M.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 en donde el sulfato de amonio está presente en una concentración de 2M.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde la solución comprende sales de sodio en un rango de concentración de 2M a 4M.

8. Procedimiento según la reivindicación 7 en donde la sal de sodio es cloruro de sodio.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 en donde la sal de sodio es cloruro de sodio en una concentración de 2M.

10. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde la solución tiene un pH en el rango de 6,8 a 7,4.

11. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde la solución tiene un pH de 7,4.

12. Procedimiento de separación de ADN plásmido superenrollado de una mezcla de ADN plásmido superenrollado y ADN plásmido relajado y, opcionalmente, al menos una impureza de célula huésped que comprende las siguientes etapas:

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde la al menos una impureza de célula huésped es seleccionada del grupo consistente en ARN, endotoxina, ADN cromosómico y proteína.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde la al menos una impureza de célula huésped es una endotoxina.

15. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO₄^2-, Cl^-, Br^-, NO₃^-, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺ y NH₄⁺.

16. Procedimiento según la reivindicación 15 en donde la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de 2,5M a 4M.

17. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde la primera condición comprende equilibrar dicho medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio que está presente en un rango de concentración de 2,5M a 4M.

18. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde la segunda condición comprende lavar el medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 2,35M a 2,45M.

19. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 1 M a 2,3M.

20. Procedimiento de separación de endotoxina de ADN plásmido que comprende contactar una mezcla de endotoxina y ADN plásmido con un medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones donde dicha endotoxina se une a dicho medio de interacción hidrofóbica para formar un complejo y separar dicho ADN plásmido y dicho complejo.

21. Procedimiento según la reivindicación 20 en donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO₄^2-, Cl^-, Br^-, NO₃^-, Mg₂⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺ y NH₄⁺.

22. Procedimiento según la reivindicación 20 en donde dicha mezcla comprende además una sal de amonio en un rango de concentración de 1,5 a 4M.

23. Procedimiento según la reivindicación 22 en donde dicha sal de amonio es sulfato de amonio que está presente en una concentración de 2M.

24. Procedimiento según la reivindicación 20 en donde dicha mezcla tiene un pH en el rango de 6,8 a 7,4.

25. Procedimiento según la reivindicación 24 en donde el pH es 7,4.

26. Procedimiento de separación de ADN superenrollado plásmido del ADN plásmido relajado que comprende contactar una mezcla de ADN plásmido superenrollado y ADN plásmido relajado con un medio de interacción hidrofóbica bajo una primera condición donde tanto el ADN plásmido superenrollado como el ADN plásmido relajado se unen a dicho medio de interacción hidrofóbica para formar una primera mezcla de unión, alterar dicha primera condición que rodea la primera mezcla de unión a una segunda condición para extraer dicho ADN plásmido relajado de dicha primera mezcla de unión para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla de unión y dicho ADN plásmido relajado, y modificar la segunda condición que rodea dicha segunda mezcla de unión hasta una tercera condición para extraer dicho ADN superenrollado plásmido de dicha segunda mezcla de unión para formar componentes separados que contiene dicho medio de interacción hidrofóbica y dicho ADN superenrollado plásmido;

en donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.

27. Procedimiento según la reivindicación 26 en donde dicha primera condición comprende equilibrar dicho medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en un rango de concentración de 2,5 M a 4 M.

28. Procedimiento según la reivindicación 27 en donde dicha segunda condición comprende lavar dicha primera mezcla de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 2,35 M a 2,45 M.

29. Procedimiento según la reivindicación 28 en donde dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 1 M a 2,3M.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 y 26 en donde dicha alteración y dicha modificación son combinados en un proceso continuo que comprende un gradiente elución de dicho ADN plásmido relajado y ADN plásmido superenrollado mediante la mezcla de dicha primera mezcla de unión con una solución de sulfato de amonio que contiene sal con una concentración continuamente variable de sulfato de amonio, dicha concentración variando de 3M a 1 M de sulfato de amonio, y dicho ADN plásmido relajado se recoge en un primer volumen eluído y dicho ADN superenrollado plásmido se recoge en un segundo volumen eluído.

31. Procedimiento según la reivindicación 26 en donde dicho componente de ADN plásmido relajado separado y dicho ADN plásmido superenrollado separado se recogen y se aíslan.

32. Procedimiento para el enriquecimiento de la cantidad de ADN superenrollado relativa al ADN relajado en una mezcla de los mismos, procedimiento que comprende:

en donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.

33. Procedimiento para extraer lipopolisacárido (LPS) de una composición que contiene ADN, procedimiento que comprende:

34. Procedimiento de enriquecimiento del ADN superenrollado relativo al ADN relajado en una mezcla de los mismos, el procedimiento que comprende:

35. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 12, 20, 26 ó 34 en donde el medio de interacción hidrofóbica comprende un soporte de cromatografía con grupos hidrofóbicos pendientes.

36. Procedimiento según la reivindicación 35 en donde dichos grupos pendientes son seleccionados del grupo consistente en C₃ a C₁₀ grupos alquil.

37. Procedimiento según la reivindicación 35 respecto a las reivindicaciones 12, 20 ó 34 en donde el medio de interacción hidrofóbica es seleccionado del grupo consistente en un polímero metacrilato o esqueleto copolímero unido a al menos uno de un propil, butil, hexil, octil, nonil o una mezcla de éstos como grupo hidrofóbico pendien- te.

38. Procedimiento según la reivindicación 35 respecto de la reivindicación 1 en donde el medio de interacción hidrofóbica es seleccionado del grupo consistente en un polímero metacrilato o esqueleto copolímero unido a al menos uno de un grupo hidrofóbico propil, butil, hexil, octil, nonil o decil.

39. Procedimiento según la reivindicación 35 respecto de la reivindicación 26 en donde el medio de interacción hidrofóbica es un polímero metacrilato o esqueleto copolímero unido a al menos un ligando propil, butil, pentil, hexil, heptil, octil, nonil o decil.

40. Procedimiento según la reivindicación 35 en donde el medio es al menos uno de esqueleto copolímero metilacrilato etilenglicol o una agarosa reticulada.

41. Procedimiento según la reivindicación 35 en donde el medio es una resina en la forma de granos en el rango de tamaño de 15 a 100 μm.

42. Procedimiento según la reivindicación 34 en donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO₄^2-, Cl^-, Br^-, NO₃^-, Mg²⁺, Li⁺ Na⁺, K⁺ y NH₄⁺.

43. Procedimiento según la reivindicación 40 en donde la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de 2,5M a 4M.

44. Procedimiento según la reivindicación 34 en donde la primera condición comprende equilibrar dicho medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio que está presente en un rango de concentración de 2,5M a 4M.

45. Procedimiento según la reivindicación 34 en donde la segunda condición comprende lavar el medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 2,35M a 2,45M.

46. Procedimiento de la reivindicación 34 en donde la dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 1M a 2,3M.