Procedimiento para el cribado de una librería de ligandos de péptidos que comprende las etapas de

(a) poner en contacto la librería de ligandos con un anti-blanco para permitir que dichos ligandos se unan a dicho anti-blanco;

(b) separar los ligandos no unidos;

(c) poner en contacto dichos ligandos no unidos con un blanco seleccionado para permitir que dichos ligandos no unidos se unan al blanco para formar un complejo de ligando unido al blanco;

(d) separar dicho complejo de ligando unido al blanco de los ligandos que no se unen a dicho blanco; y

(e) identificar los ligandos unidos al blanco del complejo de ligando unido al blanco,

en el que el anti-blanco es pelo y el blanco es piel, o en el que el anti-blanco es piel y el blanco es pelo

Procedimientos de identificación selectiva.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de selección e identificación de compuestos capaces de unirse específicamente a un blanco en presencia de blancos de fondo no deseados (anti-blancos) usando librerías de compuestos similares. La presente invención se refiere a la selección de ligandos de librerías de péptidos. Los péptidos ligandos identificados según el procedimiento de la invención tienen una afinidad y selectividad de unión a un blanco similar a la afinidad y selectividad de unión de los anticuerpos.

La bibliografía está llena de ejemplos de avances recientes en procedimientos de cribado de grandes pools de librerías de compuestos, especialmente péptidos. También se han realizado avances en los procedimientos de cribado de estos compuestos para identificar moléculas que se unen a un blanco pre-seleccionado. Un procedimiento muy conocido es el biopanning, desarrollado por Smith, G.P., (1985), Science 228:1315. El biopanning es, en su forma más sencilla, un procedimiento de selección in vitro en el que una librería de péptidos expuestos en fagos se incuba con un blanco. Entonces, se deja que el blanco y el fago se unan y los fagos no unidos se eliminan. Los fagos específicamente unidos se eluyen en medio ácido. El pool eluído de fagos se amplifica in vivo y el procedimiento se repite. Después de varios ciclos, los clones individuales se aíslan y secuencian.

Se han descrito diversas variaciones de la técnica de biopanning presentada por Smith y se hace referencia a Christian y col., (1992) J. Mol. Biol., 227:711; Cwiria y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Cull y col., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865; Huls y col., (1996) Nature Biotechnol., 7:276; y Bartoli y col., (1998) Nature Biotechnol., 16:1068.

El documento Huls y col., 1996 supra, describe un procedimiento que comprende una selección sustractiva basada en citometría de flujo de anticuerpos en fagos sobre células tumorales intactas. Los anticuerpos expuestos en fagos permanecen unidos al blanco durante la selección por citometría de flujo. Sin embargo, antes de la amplificación, los fagos unidos a las células se eluyen del blanco. El documento WO98/54312 desvela la selección de anticuerpos en condiciones suaves con elevada afinidad por antígenos usando librerías de anticuerpos expuestos en ribosomas.

En muchos procedimientos de la técnica anterior generalmente se supone que la elución de los ligandos unidos al blanco es suficiente para identificar los ligandos con la unión más fuerte de una librería. Sin embargo, diversos artículos de investigación exponen ligantes de baja afinidad usando técnicas de elución (patente estadounidense nº 5.582.981). No obstante, la separación física de los ligandos del blanco antes de la amplificación o identificación es el procedimiento estándar para la selección de ligandos que se unen a un blanco pre-seleccionado.

El documento Balass y col., (1996) Anal. Biochem., 243:264, describe la selección de péptidos-fagos con elevada afinidad de librerías de péptidos-fagos usando un blanco biotinilado inmovilizado en una matriz de nitro-estreptavidina. Las partículas de fagos que interactuaban se liberaron mediante elución ácida/en ácido convencional. Además, después de la elución ácida, el complejo diana se analizó respecto a los fagos unidos. Estas partículas se expusieron a disoluciones alcalinas o biotina libre para liberar las partículas de fagos unidos al blanco del soporte sólido. Se descubrió que la afinidad de los fagos aislados era mayor que la de los fagos liberados por los procedimientos de elución ácida tradicionales. Sin embargo, los péptidos sintéticamente preparados exhibían una menor afinidad por el blanco que los péptidos preparados a partir de secuencias obtenidas de fagos eluídos en ácido.

Otros procedimientos de identificación incluyen, por ejemplo, el método SELEX. Este es un procedimiento en el que un oligonucleótido de una librería de secuencias aleatorizadas se embebe en un pool de ácidos nucleicos. Se realizan muchos ciclos de selección de afinidad por un blanco del oligonucleótido de la población de ARN o ADN heterólogo. El blanco y los ácidos nucleicos renaturalizados se dividen y amplifican. Para realizar la etapa de amplificación, los ácidos nucleicos seleccionados se deben liberar del blanco tras dividirlo (patente estadounidense nº 5.475.096).

El documento WO99/06542A describe un procedimiento para producir una librería de bacteriófagos modificados adecuada para usar en combinación con células de una cepa seleccionada que se han transformado para que expresen una proteína heteróloga (no nativa) en un procedimiento de cribado en el que se detecta una unión específica entre un bacteriófago individual de la librería y un sitio/TODOS de reconocimiento de la proteína heteróloga.

Aunque existen diversos procedimientos de cribado y selección de librerías de compuestos, son especialmente necesarios procedimientos mejorados que no requieran múltiples ciclos de selección para compuestos que a) se unen fuerte y específicamente a blancos que no están bien definidos a nivel químico, bioquímico o genético pero que tienen propiedades macroscópicas deseables de identificar, b) se unen fuerte y específicamente a blancos que no se pueden separar físicamente de forma sencilla de un gran fondo de blancos no deseados (anti-blancos), y c) se unen a blancos en condiciones severas, tales como pH ácido, concentración de detergentes elevada o temperatura elevada.

El procedimiento de identificación selectiva según la invención soluciona algunas de las deficiencias anteriores de los procedimientos de la técnica anterior y, en concreto, ofrece la ventaja de identificar rápidamente péptidos, que se unen con gran afinidad y selectividad a un blanco.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de cribado de una librería de ligandos de péptidos que comprende poner en contacto la librería de ligandos con un anti-blanco para permitir que los ligandos se unan al anti-blanco; separar los ligandos no unidos y poner en contacto dichos ligandos no unidos con el blanco seleccionado para permitir que dichos ligandos no unidos se unan al blanco para formar un complejo de ligando unido al blanco; separar dicho complejo de ligando unido al blanco de los ligandos que no se unen a dicho blanco; e identificar los ligandos unidos a blancos del complejo de ligando unido al blanco, en el que el anti-blanco es pelo y el blanco es piel, o en el que el anti-blanco es piel y el blanco es pelo.

En una realización preferida, la selectividad de unión de ligando a un blanco en comparación con la unión de los ligandos a un anti-blanco es de aproximadamente al menos 10:1. En una segunda realización preferida, el ligando es un péptido pero no un anticuerpo y está unido al blanco con una K_D de al menos aproximadamente 10^-7 M y, preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 10^-7 M a 10^-10 M. La librería de ligandos es una librería de péptidos. Preferiblemente, los péptidos identificados según el procedimiento tienen una longitud de 25 aminoácidos y, preferiblemente, tienen una longitud de entre 4 y 15 aminoácidos. En una cuarte realización, k_off es de aproximadamente 10^-4 s^-1 o inferior.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Es un diagrama esquemático general del procedimiento de identificación selectiva desvelado en el presente documento. El procedimiento comprende las etapas de a) selección frente a anti-blancos, lo que proporciona una librería de ligandos carente de ligandos unidos a anti-blancos, b) selección del blanco mediante formación de un complejo de ligando unido al blanco, b) separación del complejo de ligando unido al blanco, d) identificación de los ligandos unidos a blancos, y e) secuenciación, opcionalmente, de los ligandos unidos a blancos, exponiendo los ligandos unidos a blancos a ciclos adicionales de identificación selectiva y/o diversificación.

Figuras 2A Y 2B. Son fotografías de un gel fragmentos de ADN amplificados por PCR después de la lisis del fago unido al blanco. La figura 2A ilustra un fago unido a TNF-a y la figura 2B ilustra un fago unido a IL-6 e IL-8.

Figura 3. Es una fotografía de un gel de fragmentos de ADN amplificados por PCR para solo para los identificados.

Figura 4. Ilustra la unión, disociación y elución intentada...

1. Procedimiento para el cribado de una librería de ligandos de péptidos que comprende las etapas de

(a) poner en contacto la librería de ligandos con un anti-blanco para permitir que dichos ligandos se unan a dicho anti-blanco;

(b) separar los ligandos no unidos;

(c) poner en contacto dichos ligandos no unidos con un blanco seleccionado para permitir que dichos ligandos no unidos se unan al blanco para formar un complejo de ligando unido al blanco;

(d) separar dicho complejo de ligando unido al blanco de los ligandos que no se unen a dicho blanco; y

(e) identificar los ligandos unidos al blanco del complejo de ligando unido al blanco,

en el que el anti-blanco es pelo y el blanco es piel, o en el que el anti-blanco es piel y el blanco es pelo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que k_off es aproximadamente 10^-4 s^-1 o inferior.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ligando unido al blanco se une con una selectividad correspondiente a al menos 10:1 y tiene una K_D de al menos aproximadamente 10^-7 M.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que cada etapa (a), (b), (c) o (d) se repite entre 2 y 10 veces.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los ligandos unidos al blanco son péptidos de longitud inferior a 25 aminoácidos.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el blanco es piel.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el blanco es pelo.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de identificación comprende emplear PCR del ligando unido al blanco.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos ligandos son para uso en una aplicación de cuidado personal.