Procedimientos de cultivo semicontinuo de estreptococos.

Un procedimiento para cultivar estreptococos, en el que el estreptococo se hace crecer en un cultivo semicontinuoy el procedimiento se divide en una fase discontinua;

una fase semicontinua en la que se usa un nivel de nutrientelimitante para limitar el crecimiento y para mantener el cultivo a un tiempo de duplicación deseado; y una fase desuministro de carbono en la que se proporciona una fuente adicional de carbono de forma que se hagan limitanteslos nutrientes distintos al carbono.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2006/003938.

Solicitante: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS S.R.L..

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA FIORENTINA 1 53100 SIENA (SI) ITALIA.

Inventor/es: SWENNEN,ERWIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/09 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Streptococcus.
  • C12N1/20 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12P19/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.

PDF original: ES-2398664_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimientos de cultivo semicontinuo de estreptococos

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de los cultivos bacterianos y específicamente, se refiere a la optimización 5 de las condiciones de cultivo para mejorar la producción de polisacáridos capsulares bacterianos.

Técnica antecedentes Los polisacáridos capsulares (cps) son importantes inmunógenos implicados en diversas enfermedades bacterianas. Esta característica ha hecho de ellos un importante componente en el diseño de vacunas. Han demostrado ser útiles para desencadenar respuestas inmunitarias cuando se unen a proteínas portadoras [1]. Típicamente, los 10 polisacáridos capsulares se producen usando un cultivo discontinuo en un medio complejo (estreptococos del grupo B, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae) , un cultivo semicontinuo (H. influenzae) o un cultivo continuo (estreptococos del grupo B y Lactobacillus rhamnosus) [2 -7]. La mayoría de los estudios usan sistemas de cultivo discontinuos en los que la tasa de crecimiento, los niveles de nutrientes y las concentraciones metabólicas varían durante la incubación. En dichos sistemas, la alteración de un factor da como 15 resultado cambios en los factores asociados con el crecimiento. Los cultivos continuos permiten al investigador separar y definir parámetros que son independientes durante el crecimiento del cultivo discontinuo, tales como la tasa de crecimiento, las concentraciones de nutrientes y de producto y la densidad celular. Durante el cultivo continuo se añade medio nuevo a un cultivo a una tasa fija, y las células y el medio se eliminan a una tasa que mantiene un volumen de cultivo constante. Se prefería el cultivo continuo para la producción de polisacáridos capsulares cuando se demostró que era dependiente de las condiciones [8].

Para los estreptococos del grupo B (GBS, S. agalactiae) , se notificó que la tasa de crecimiento celular era el principal factor regulador de la producción de los polisacáridos capsulares. Adicionalmente, se demostró que la producción de polisacáridos capsulares de tipo III se producía independientemente del nutriente limitante del crecimiento. Se obtuvieron mayores rendimientos específicos (de hasta aproximadamente 90 mg/g en PS) cuando las células se mantenían en un tiempo de duplicación de masa rápido (0, 8, 1, 4 ó 1, 6 h) [td] en lugar de un tiempo lento (td = 2, 6 u 11 h) [8 -10]. Sin embargo, el cultivo continuo tiende a forzar problemas de estabilidad y de contaminación. Adicionalmente, el cultivo continuo es un tanto caro debido al suministro continuo de medio de nutrientes.

Hay por lo tanto una necesidad de encontrar alternativas al cultivo continuo para la producción con alto rendimiento de polisacáridos capsulares con objeto de superar los problemas del cultivo continuo que se mencionaron anteriormente.

Divulgación de la invención Los inventores han descubierto que pueden obtenerse altos rendimientos de polisacáridos capsulares para cualquier cepa de estreptococos usando un cultivo semicontinuo, que es un cultivo que se inicia con la inoculación de células en un volumen finito de medio nuevo y se termina con una única recogida después de que han crecido las células, añadiéndose nutrientes adicionales al cultivo una vez que se ha agotado la fuente inicial de nutrientes. Dichos elevados rendimientos son comparables o mejores a los obtenidos usando cultivos continuos. Adicionalmente, los procedimientos desvelados en el presente documento no tienden a los problemas de estabilidad y de contaminación del cultivo continuo.

La invención proporciona un procedimiento para cultivar estreptococos según la reivindicación 1. Preferiblemente, el estreptococo es un GBS. El cultivo semicontinuo puede ser semicontinuo de volumen fijo o semicontinuo de volumen variable. En el cultivo semicontinuo de volumen fijo se suministra un sustrato limitante sin diluir el cultivo (por ejemplo, usando un líquido concentrado o un gas o mediante el uso de diálisis) . En el cultivo semicontinuo de volumen variable, el volumen cambia durante el tiempo de fermentación debido al suministro de sustrato. Se sabe 45 que algunas cepas de estreptococos son "malas productoras" de polisacáridos capsulares porque típicamente sólo producen bajos niveles polisacáridos capsulares en cultivo. Algunos ejemplos de dichos malos productores incluyen las cepas de GBS DK21 y 2603. Sin embargo, usando los procedimientos desvelados en el presente documento, pueden obtenerse altos niveles de polisacáridos capsulares incluso partir de dichos "malos productores".

Preferiblemente, el procedimiento de la invención es aquel en el que se produce un alto rendimiento de polisacáridos 50 capsulares. Preferiblemente, el rendimiento de polisacáridos capsulares es de 10 mg/g en PS (mg de polisacáridos capsulares por g en peso seco de bacterias) o más (por ejemplo, de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o más) , y más preferiblemente > 30 mg/g en PS. Preferiblemente, el rendimiento de polisacáridos capsulares del medio de cultivo es de 10 mg/l o más (por ejemplo, de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300 o más) . Más preferiblemente, el rendimiento de 55 polisacáridos capsulares del medio de cultivo es de 50 mg/l o más (por ejemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 o más) . Por lo tanto, el procedimiento de la invención permite la producción de polisacáridos capsulares con un rendimiento mucho mayor por unidad de volumen en comparación con el cultivo continuo. En algunos casos, el rendimiento por unidad de volumen puede ser del doble o más del doble que el producido usando un cultivo continuo.

El procedimiento de cultivo global se divide en fases específicas (discontinuo, semicontinuo y con suministro de carbono) , que pueden subdividirse adicionalmente. Inicialmente, se inicia un cultivo discontinuo durante el cual la tasa de duplicación del cultivo (!) aumenta para conseguir un tiempo de duplicación bajo (td) . El td puede aumentar entonces durante una primera fase semicontinua (FB1) hasta alcanzar el valor de producción deseado. Esta tasa de duplicación puede mantenerse entonces en un nivel estacionario durante una segunda fase semicontinua (FB2) . Entonces se inicia un suministro de carbono (GF) que da como resultado un aumento del td según van desapareciendo del medio los ingredientes no auxótrofos pero limitantes. La fase semicontinua inicial permite que la bacteria comience el crecimiento y consiga un td bajo. Las fases semicontinua y de suministro de carbono permiten la producción en polisacáridos capsulares a una tasa elevada. La fase semicontinua proporciona nutrientes al cultivo según se van usando. La fase de suministro de carbono proporciona una fuente de carbono adicional, de forma que otros nutrientes se vuelven limitantes.

El elevado rendimiento puede mantenerse cultivando las bacterias a un bajo td durante la fase semicontinua. Preferiblemente, este bajo td se mantiene a lo largo de la segunda fase semicontinua (FB2) en particular. Preferiblemente, el td es de 80 minutos o menos, preferiblemente de 60 minutos o menos (por ejemplo, de 58, 56, 54, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 25, 20, 15 o menos) . Preferiblemente, el td es de aproximadamente 45 minutos (0, 75 h) (por ejemplo, de 0, 6 -1, 0 h) . El td puede ajustarse usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como la temperatura y la concentración de oxígeno, o limitando los niveles de nutrientes.

Como apreciará la persona experta, el td puede ser monitorizado mediante cualquiera de varios factores limitantes. Generalmente, las bacterias se dejan crecer libremente hasta que se ha alcanzado un td deseado (la fase "discontinua") , después de lo cual se inicia un mecanismo de control para mantener el td (la fase "semicontinua") . Preferiblemente, durante la fase de crecimiento libre, el suministro de carbono no es un factor limitante. Sin embargo, una vez que se ha alcanzado el td deseado, puede usarse cualquiera de los varios factores limitantes, incluyendo el suministro de carbono (aunque no es preferido) , para limitar el crecimiento y mantener el cultivo al td deseado.

Con objeto de mantener los niveles de carbono durante la producción de polisacáridos capsulares, se prefiere que se mantenga la concentración de la fuente de carbono usando un suministro dependiente del pH. Dicho suminis puede iniciarse desde el comienzo del cultivo o únicamente cuando se haya conseguido un td específico. Sin embargo, si el suministro se comienza después del inicio del cultivo, la tasa de suministro debe mantenerse mayor que la tasa de consumo para evitar que la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para cultivar estreptococos, en el que el estreptococo se hace crecer en un cultivo semicontinuo y el procedimiento se divide en una fase discontinua; una fase semicontinua en la que se usa un nivel de nutriente limitante para limitar el crecimiento y para mantener el cultivo a un tiempo de duplicación deseado; y una fase de suministro de carbono en la que se proporciona una fuente adicional de carbono de forma que se hagan limitantes los nutrientes distintos al carbono.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el rendimiento de polisacárido capsular es > 10 mg de polisacárido capsular/g en PS.

3. El procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que la fase semicontinua se subdivide adicionalmente en una primera fase semicontinua en la que el tiempo de duplicación del cultivo se aumenta hasta un valor deseado, y una segunda fase semicontinua en la que el tiempo de duplicación se mantiene en un estado estacionario.

4. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que las bacterias se cultivan a un td de 0, 6 -1, 0 h durante una fase semicontinua.

5. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que el cultivo semicontinuo comprende el suministro de un medio complejo.

6. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que el cultivo tiene una fase discontinua, seguida por una fase semicontinua, en el que durante la fase semicontinua el td se mantiene a 80 minutos o menos.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el td se mantiene a 45 minutos.

8. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que el nivel de carbono se mantiene usando un suministro dependiente del pH.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el suministro dependiente del pH es un suministro de glucosa dependiente del pH.

10. Un procedimiento según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que el suministro dependiente del pH se controla mediante un punto de pH establecido (pHc) en el que cuando el pH del cultivo supera el pHc, se añade la fuente de carbono al medio, y cuando el pH del cultivo cae por debajo del pHc, se detiene el suministro de carbono.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que el pHc está entre 6 y 8.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que el pHc es 7, 2.

13. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que el estreptococo es un estreptococo del grupo

B.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que el estreptococo del grupo B es el serotipo Ia, Ib, III, IV o V.

15. Un procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que el estreptococo del grupo B está seleccionado de entre las cepas 090, 7357, H36b, DK21, M781 y 2603.

16. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, en el que el cultivo tiene un suministro de oxígeno.

17. Un procedimiento que comprende a) cultivar estreptococos en un cultivo semicontinuo mediante un procedimiento según cualquier reivindicación previa, y b) preparar el polisacárido capsular a partir de las bacterias.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, que comprende adicionalmente la etapa c) conjugar el sacárido capsular con una proteína portadora, para dar un conjugado de proteína-sacárido.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que la proteína portadora es el toxoide diftérico, el toxoide tetánico del mutante CRM197 de la toxina diftérica.

20. Un procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que el conjugado se obtiene mediante la oxidación del polisacárido seguido por una aminación reductora con la proteína.

21. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el conjugado tiene una proporción de sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 y 5:1.

22. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, que comprende adicionalmente la etapa de mezclar los conjugados individuales preparados a partir de uno o más estreptococos del grupo B de los serogrupos Ia, Ib o III para proporcionar una mezcla polivalente.

23. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, que comprende adicionalmente la etapa de mezclar los conjugados individuales para proporcionar una mezcla bivalente, trivalente, tetravalente, pentavalente, hexavalente, heptavalente o undecavalente.

24. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica, que comprende las etapas de: a) preparar un

conjugado mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, y b) mezclar el conjugado con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

25. Un procedimiento según la reivindicación 24, que comprende adicionalmente la etapa de: c) mezclar el producto de la etapa b) con un coadyuvante.

26. Un procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, que comprende adicionalmente la etapa de: d) envasar la 10 mezcla de conjugado/portador en un recipiente, tal como un vial o una jeringa, para dar un producto farmacéutico.


 

Patentes similares o relacionadas:

Diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) o sus precursores, del 8 de Julio de 2020, de Glycom A/S: Un metodo de preparacion de una mezcla diversificada que comprende dos o mas oligosacaridos de la leche humana (HMO), el metodo comprende las etapas de […]

Método de producción de compuestos de inclusión de flavonoide, del 3 de Junio de 2020, de TAIYO KAGAKU CO., LTD.: Un método de producción de un compuesto de inclusión de flavonoide, que comprende una etapa de escisión que comprende tratar un flavonoide escasamente […]

Métodos para la degradación o la conversión de polisacáridos de la pared celular vegetal, del 6 de Mayo de 2020, de NOVOZYMES, INC.: Metodo para degradar o convertir los polisacaridos de la pared celular vegetal en uno o mas azucares, que comprende: tratar los polisacaridos de la pared celular vegetal con […]

Construcción de nuevas variantes de dextransacarasa DSR-S por ingeniería genética, del 6 de Mayo de 2020, de CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE: 1. Una dextransacarasa que consiste en una secuencia que tiene el 90 %, el 95 % o el 98 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del fragmento […]

Procedimiento para la purificación de hidrolizado de biomasa, del 29 de Abril de 2020, de CLARIANT INTERNATIONAL LTD.: Un procedimiento para la purificación de hidrolizado de biomasa que comprende las etapas a) Proporcionar un hidrolizado de biomasa, en el que el hidrolizado […]

Construcción de nuevas variantes de dextransacarasa DSR-S por ingeniería genética, del 22 de Abril de 2020, de CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE: Una secuencia de nucleótidos que consiste en una secuencia de nucleótidos como se define en SEQ ID NO: 1 o la secuencia complementaria a la secuencia como […]

Transsialidasas de photobacterium mutadas, del 15 de Abril de 2020, de Glycom A/S: Una α2,6-transsialidasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID […]

Exopolisacárido para el tratamiento y/o cuidado de la piel, mucosas, cabello y/o uñas, del 11 de Marzo de 2020, de LUBRIZOL ADVANCED MATERIALS, INC.: Uso del exopolisacárido de la cepa de las especies de Vibrio sp. con número de depósito CNCM I-4277, para mejorar la hidratación de la piel, mucosas, […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .